Микроскопические методы исследования - способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основусоставляет световая и электронная микроскопия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей - вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

Для световой микроскопии и основанных на ней других микроскопических методов исследования определяющее значение помимо разрешающей способности микроскопа имеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света - его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные микроскопические методы исследования . Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1 ). При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные микроорганизмы и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1 / 4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т.д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях - отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис. 2 ). Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования , способом микробиологической диагностики , находит применение в цитологических исследованиях и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение - люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витамины и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей - флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях (см. Гистохимические методы исследования ). С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные антигены и их концентрацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела, гормоны, различные продукты метаболизма и т.д. (рис. 3 ). В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как герпес, эпидемический паротит, вирусный гепатит, грипп и др., используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т.д.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400-250 нм ). Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов - их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750-1200 нм . Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот вид микроскопических методов исследования наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии , в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться отних (сканирующая электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур (рис. 4 ), при сканирующей - объемное (рис. 5 ). Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования , позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30-50 нм . Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. См. также

В данной статье мы ознакомимся широко развитой методикой исследования разнообразных микроэлементов нашего мира - микроскопией. Здесь мы рассмотрим описание микроскопа, его предназначение, устройство, правила работы и исторические факты.

Ознакомление с приборами микроскопии

Микроскоп - это механизм, предназначение которого заключается в получении увеличенного изображения какого-либо объекта, а также в измерении структурных деталей, которых невозможно наблюдать невооруженным глазом.

Изобретение и создание разнообразных видов микроскопов позволило создать микроскопию - технологический метод практической эксплуатации этих приборов.

Исторические сведения

Кем был создан первый микроскоп в истории человечества, определить довольно проблематично. Впервые такой механизм был изобретен на рубеже шестнадцатого и семнадцатого веков. Вероятным изобретателем считают Захария Янсена, голландского ученого.

Будучи еще ребенком, Янсен используя дюймовую трубочку, установил на двух ее краях по одной выпуклой линзе. Увиденное заставило изобретателя создать нечто новое и улучшить его. Возможно, это обусловило изобретение первого в мире микроскопа, что произошло приблизительно в 1590 году.

Однако еще в 1538 г. итальянец Дж. Фракасторо, работая врачом, выдвинул предположение о комбинировании двух линз с целью создания еще большего увеличения изображений. Следовательно, его работа могла стать началом для появления первого микроскопа. Хотя термин был введен гораздо позже.

Другим первооткрывателем считается Галилео Галилей. Услышав приблизительно в 1609 г. о появлении такого увеличительного устройства и разобравшись в общей идее его механизма, уже в 1612 г. итальянский физик создал собственное массовое изготовление микроскопов. Название этому прибору дал академический друг Галилея, Джованни Фабер в 1613.

Уже в шестидесятых годах XVII века были получены данные о применении микроскопа в научной исследовательской деятельности. Первый это сделал Роберт Гук, занимавшийся наблюдением за устройством разнообразных растений. Именно он в работе «микрография» сделал зарисовки увиденного в микроскоп изображения. Он установил, что растительные организмы строятся из клеток.

Разрешающие способности

Одним из параметров микроскопа является его разрешающая способность. Различные виды микроскопов имеют, соответственно, разный показатель этой характеристики. Так что же это такое?

Разрешающая способность - это возможности прибора показывать четкое и качественное изображение, картинку двух расположенных рядом, фрагментов исследуемого объекта. Показатель степени углубления в микромир и общая возможность его исследования базируются именно на этой способности. Данную характеристику определяет длина волны излучения, которую используют в микроскопе. Главным ограничением является невозможность получения картинки объекта, размеры которого меньше размера длины излучения.

Ввиду написанного выше становится очевидно, что благодаря разрешающей способности мы можем получать четкое изображение деталей изучаемого объекта.

Основные параметры

К другим важным параметрам в строении микроскопа относятся его увеличение, насадки, размер предметного столика, возможности подсветки, оптическое покрытие и т. д.

Рассмотрим главный из перечисленных в этом пункте показателей - увеличение.

Увеличение - это общая способность микроскопа показывать изучаемые объекты в больших размерах, чем они есть на самом деле. Вычисление этого параметра можно произвести путем умножения объективного увеличения на окулярное. Данная возможность в оптических микроскопах доходит до 2000 крат, а электронный имеет увеличение в сотни раз больше, чем световой.

Основная характеристика микроскопа - это именно его разрешающая способность, а также увеличение. Поэтому при выборе такого прибора на эти показатели необходимо обратить особое внимание.

Составные элементы

Микроскоп, как и любой другой механизм, состоит из определенных деталей, среди которых выделяют:

предметный столик;
рукоятку переключения;
окуляр;
тубус;
держатель для тубуса;
микрометренный винт;
винт грубой наводки;
зеркальце;
подставку;
объектив;
стойку;
бинокулярную насадку;
оптическую головку;
конденсор;
светофильтр;
ирисовую диафрагму.

Ознакомимся с основными характеристиками образующих структур микроскопа.

Объектив - является средством определения полезного увеличения. Образуется из определенного количества линз. Увеличительные возможности указываются цифрами на его поверхности.

Окуляр - состоящий из двух-трех линз элемент микроскопа, увеличение которого обозначается на нем цифрам. Общий показатель увеличительных способностей прибора определяется путем перемножения показателя увеличения объектива на увеличение окуляра.

Осветительные устройства включают в себя зеркальце или электроосветитель, конденсор и диафрагмой, светофильтр и столик.

Механическая система образуется подставкой, коробочкой с микрометренным механизмом и винтом, тубусодержателем, винтом грубой наводки, конденсором, винтом перемещения конденсора, револьвером и предметным столиком.

Оптическая микроскопия

Среди существующих видов микроскопов выделяют несколько основных групп, характеризующихся определенными особенностями устройства и предназначения.

Глаз человека - это своего рода естественная оптическая система с определенными параметрами, например, разрешением. Разрешение, в свою очередь, характеризуется наименьшим показателем разности в расстоянии между составными компонентами объекта, за которым наблюдают. Важнейшим пунктом здесь является наличие визуального отличия между наблюдаемыми фрагментами. Ввиду того, человеческий глаз не в силах наблюдать естественным путем за микроорганизмами, как раз и были созданы подобные увеличительные приборы.

Оптические микроскопы позволяли работать с излучением, лежащем в диапазоне от 400 до 700 нм и с ближним ультрафиолетом. Это длилось до середины двадцатого века. Подобные приборы не позволяли получать разрешающую способность меньшую, чем полупериод волны излучения опорного типа. Вследствие этого микроскоп позволял наблюдать за структурами, расстояние между которыми было около 0.20 мкм, из чего следует, что максимальное увеличение могло достигать 2000 крат.

Микроскопы бинокулярного типа

Бинокулярный микроскоп - это устройство, при помощи которого можно получить объемное увеличенное изображение. Другое название таких приборов - стереомикроскопы. Они позволяют человеку четко различать детали исследуемых объемных объектов.

В бинокулярном микроскопе рассмотрение объекта происходит сквозь две линзы, независимые между собой. В настоящее время используются сразу 2 окуляра и 1 объектов. Отлично работают в условиях наличия проходящего и отраженного света.

Электронная микроскопия

Появление электронного микроскопа позволило использовать электроны, обладающие свойствами и частиц, и волн в микроскопии.

Электрон обладает длинной волны, которая зависит от его энергетического потенциала: E = Ve, где V - величина разности потенциалов, e - электронный заряд. Длина волны электрона при пролете разности в потенциалах равной 200000 В составит около 0,1 нм. Электрон легко фокусируется при помощи электромагнитных линз, что обуславливается его зарядом. После электронную версию изображения переводят в видимую.

Среди таких увеличительных устройств набрал широкую известность цифровой микроскоп. Он позволяет подключать адаптеры к аппарату с целью переноса изображения на компьютер и его сохранения. При работе с подобными устройствами камера регистрирует наблюдаемое изображение, далее переносит его на ПК при помощи USB-кабеля.

Цифровой микроскоп может классифицироваться в соответствии с его режимом работы, увеличительной кратности, числу подсветок и разрешению камеры. Их главными достоинствами считаются наличие возможности переносить изображение на ПК и сохранять его, возможность в пересылке полученной информации на большие расстояния, редактирование, детальный анализ и хранение результатов исследования, а также умение проецировать картинку при помощи проекторов.

Электронные микроскопы обладают разрешающей способностью превосходящей световые в 1000-10000 раз.

Сканирующие зонды

Другой вид микроскопа - это сканирующий зонд. Сравнительно новая ветвь в развитии таких приборов.

Сокращенно их называют - ЗСМ. Изображение воспроизводится благодаря регистрации взаимодействия зонда и поверхности, которую он исследует. В современном мире такие механизмы позволяют наблюдать за взаимодействием зонда с атомами. Разрешающая способность ЗСМ сопоставима с микроскопами электронного типа, а в некоторых параметрах даже лучше.

Рентгеновская микроскопия

Рентгеновский микроскоп был создан для наблюдением за чрезвычайно малыми объектами, величина которых сопоставима с рентгеновскими волнами. Базируется на эксплуатации излучения электромагнитного характера, в котором длина волны не превышает один нанометр.

Разрешающая способность таких микроскопов заняла промежуточное место между оптическими и электронными. Теоретическая р.с. такого устройства может достигать 2-20 нм, что гораздо больше возможностей оптических микроскопов.

Общие сведения для работы с микроскопом

Эксплуатируя данный прибор необходимо знать правила работы с микроскопом:

Работу необходимо выполнять сидя.
Следует осмотреть прибор и протереть от пыли мягкими салфетками зеркальце, объектив и окуляр.
При работе с микроскопом нежелательно его передвигать, поставить слева от себя.
Произвести открытие диафрагмы, привести конденсор к верхнему положению.
Работу стоит начинать с малого увеличения.
Объектив довести до одного сантиметра от стекла с наблюдаемым объектом.
Равномерно распределить освещение поля зрения, используя окуляр, в который необходимо смотреть глазом, и вогнутое зеркало.
Переместить микропрепарат на столик микроскопа. Наблюдая сбоку, опустить объектив до уровня 4-5 мм над исследуемым объектом, используя для этого макровинт.
Глядя глазом в окуляр, производить вращательные движения грубого винта, для подведения объектива к положению, в котором будет четко видно изображение.
Перемещая стекло с препаратом, найдите место, где исследуемый объект будет располагаться по центру вашего поля зрения в микроскопе.
В случае отсутствия изображения, повторите с шестого по девятый пункты.
Используя микрометренный винт, добейтесь необходимой четкости изображения. Обратит внимание на то, не выходит ли точка между рисками на микрометренном механизме, за пределы рисок. Если выходит, то верните ее в стандартное положение.
Заключаем правила работы с микроскопом, уборкой рабочего места. Необходимо вернуть увеличение с большого на малое, произвести поднятие объектива, снять препарат и протереть микроскоп, далее накрыть полиэтиленом и вернуть в шкафчик.

Данные правила в большей мере относятся к оптическим микроскопам. Строение микроскопа, например, электронного или рентгеновского, отличается от светового, а потому основные правила работы могут также отличаться. Особенности работы с такими устройствами можно найти в инструкции к ним.

Микроскопия - это исследование объектов с помощью особых увеличительных приборов - микроскопов.

Для получения увеличенных изображений в микроскопах используют проходящее или отраженное от объекта квантовое излучение различного вида (видимого диапазона, ультрафиолетовое или рентгеновское), а также потоки элементарных частиц (поток электронов). Поэтому существует несколько разновидностей микроскопического метода: световая, ультрафиолетовая, рентгеновская, электронная микроскопии. Наиболее распространены в цитологии и гистологии световая и электронная микроскопии.

Методы микроскопирования позволяют наблюдать и изучать только такие объекты или их структуры, размеры которых превосходят половину длины волны излучения, используемого в конкретном методе. Таким образом, основной характеристикой любого микроскопа является значение его предельного разрешаемого расстояния d (разрешающая способность, или разрешение).

Разрешение - это наименьшее расстояние между двумя точками объекта, при котором они видны раздельно; наименьший размер объекта, при котором микроскоп еще «разрешает» рассмотреть детали изображения.

Теоретически предельная разрешающая способность выражается формулой, из которой следует, что чем короче длина волны излучения, используемого в микроскопе, тем выше его разрешение и, следовательно, больше максимальное увеличение. Разрешение светового микроскопа равно 0,25 мкм, так как средняя длина волны кванта света видимого диапазона равна 0,5 мкм, что позволяет увеличивать изображение в 1500 раз.

В электронном микроскопе длина волны потока электронов равняется 0,000005 мкм, поэтому он позволяет рассматривать объекты, размеры которых в 100 000 раз меньше, и практически достигать увеличений в 1 000 000 раз.

Объект в микроскопах может освещаться двумя основными способами: излучение проходит через него или отражается. В первом случае исследуют внутреннюю структуру, во втором - поверхность объекта.

Микроскопы, в которых используют разные способы освещения, значительно различаются по конструкции и имеют разные названия: просвечивающие (трансмиссионные) - микроскопы проходящего света; микроскопы отраженного света - сканирующие (растровые).

Наиболее часто в клинической и экспериментальной практике применяют световой микроскоп, позволяющий изучать гистологические препараты в проходящем свете и светлом поле.

При световой микроскопии для достижения специальных цепей применяют и другие методы изучения и наблюдения гистологического препарата. Эти методы реализуют с помощью дополнительных приставок и устройств к обычным биологическим микроскопам или с помощью специализированных микроскопов.

Широко используют метод темного поля, когда объект освещается только косым светом с боковых сторон, поэтому детали объекта контурно выделяются на темном фоне.

Метод фазового контраста предполагает, что объект освещают два луча со сдвинутой на четверть длиной волны фазы. Проходя через объект с разных сторон и дополнительно сдвигаясь по фазе структурами препарата, эти лучи в области первичного изображения скрещиваются. Вследствие интерференции происходит сложение или вычитание их амплитуд, что выражается в сильном изменении яркости структур объекта и сильном повышении его зрительного контраста.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на флюоресценции - вынужденном свечении некоторых веществ, входящих в состав клеточных и тканевых структур, при освещении их лучами света с короткой длиной волны (первичная флюоресценция) или на флюоресценции специальных люминесцентных красителей (флюорохромов), которыми окрашивают препарат (вторичная люминесценция). При этом возбуждающий люминесценцию свет задерживается специальным (запирающим) фильтром окуляра и флюоресценция становится видна в поле зрения микроскопа. Этот метод позволяет выявлять не только невидимые с помощью других методов структуры клеток и тканей, но и судить об их качественном химическом составе.

Поляризационная микроскопия основана на способности некоторых веществ клеток и тканей вращать плоскость поляризации световых лучей. Объект освещают поляризованным светом, прошедшим через поляризационный фильтр. Перед окуляром ставят второй поляризационный фильтр (анализатор), располагая его плоскость поляризации перпендикулярно первому фильтру (поляризатору). Свет не пройдет в окуляр, но если в плоскости поля зрения находятся структуры, например коллагеновые волокна, способные вращать плоскость поляризации световых лучей (обладающие анизотропией), их изображение можно наблюдать. По особенностям изображения поляризационная микроскопия напоминает темнопольную.

Изображение регистрируют фото — и видеокамерами, в том числе и цифровыми, позволяющими вводить изображение в компьютер и обрабатывать его электронными методами с последующим выводом на экран монитора или распечатывать.

При электронной микроскопии источник света заменен источником электронов (электронная пушка), с помощью высокого напряжения (100 000 В) разогнанных до большой скорости. Электроны, прошедшие через изготовленный по особым методикам препарат, находящийся в вакууме, фокусируются не стеклянными, а электромагнитными линзами, играющими роль объектива и окуляра, и проецируются на экран, покрытый люминофором. Подобно экрану телевизора под действием электронов он светится в видимом диапазоне, позволяя видеть увеличенные в сотни тысяч раз структуры объекта. Если узкий электронный луч не проходит через препарат, а последовательно пробегает (сканирует) его поверхность, в результате чего образуется трехмерное изображение, то данная разновидность электронного микроскопа называется растровой (сканирующей).

В большинстве случаев, чтобы сделать объект пригодным для морфологического исследования с помощью микроскопа, ткани и органы подвергают сложной предварительной подготовке, в результате которой получают цитологический препарат.

Цитологический препарат может быть временным, если он служит для одномоментного исследования и не предназначен для длительного хранения, и постоянным, который делают с расчетом на многократное повторное изучение и сохраняют неопределенное время.

Для качественных исследований в цитологии используют различные цито — и гистохимические методы, которые позволяют установить локализацию определенных веществ или биохимических процессов в тканевых и клеточных структурах.

Цитохимические реакции чаще всего проводят на криостатных (приготовленных с помощью замораживающего микротома) срезах. О локализации исследуемого вещества судят по отложению окрашенного продукта реакции. Например, для выявления в клетках ДНК и РНК применяют реактив Фельгена, который дает с нуклеиновыми кислотами розово-фиолетовую окраску. Гликоген выявляют с помощью ШИК-реакции (реактив Шиффа и йодная кислота), продукты которой имеют ярко-малиновую окраску.

Разновидностью гистохимического исследования является иммуногистохимическая методика, принцип которой основан на специфическом взаимодействии меченых антител (АТ) с тканевыми антигенами (АГ). Для мечения антител применяют люминесцентные красители (флюорохромы), а также ферменты (пероксидазу хрена) или электронно-плотные частицы для электронной иммуногистохимии (коллоидное золото). При прямом методе меченые антитела непосредственно взаимодействуют с антигенами, при непрямом методе немеченые (первые) антитела специфически и взаимодействуют с антигенами ткани, меченые (вторые) взаимодействуют с немечеными (первыми) антителами, которые для вторых антител являются антигеном, что значительно повышает чувствительность метода.

Из других качественных методов следует упомянуть об авторадиографии, которая позволяет изучать процессы метаболизма в т метках и тканях с помощью радиоактивной метки, включенной в состав биологического субстрата, используемого клеткой. Место локализации метки можно обнаружить по почернению фотоэмульсии, которой покрывают препарат.

Гибридизацией in situ изучают локализацию генов и их экспрессию. С помощью короткого отрезка меченой нуклеиновой кислоты можно найти и пометить соответствующую ей последовательность нуклеиновых кислот в клетке. Локализацию метки, по которой судят о локализации или экспрессии исследуемого гена, обычно выявляют радиоавтографическим методом. С помощью гибридизации можно специфически выявить очень малые концентрации синтезируемых клеткой веществ.

Количественные методы в гистологии необходимы для получения объективных данных об изменениях клеточных структур в норме, в эксперименте или при патологии. Основные количественные показатели структурных компонентов клеток и тканей - это морфометрические (число структур и их геометрические размеры) и денситометрические (отражающие концентрацию, оптическую плотность химических веществ в этих структурах) параметры. Для их выявления применяют морфометрические и спектрофотометрические методы.

Морфометрический метод включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследуемых объектов. Число структур, их площади, диаметры, периметры и другие показатели измеряют с помощью специальных морфометрических сеток, курвиметра и метода вычисления весовых соотношений путем взвешивания. Микроструктуры в световых микроскопах измеряют с помощью окуляр-микрометра или вставляемых в окуляр морфометрических сеток. Также морфометрию проводят по изображениям исследуемых объектов на фотографиях. Морфометрический анализ в последние годы усовершенствовали за счет внедрения компьютерных методов. С помощью цитоспектрофотометрии определяют химический состав, концентрацию и количество различных веществ, содержащихся в конкретных структурах клеток и тканей с помощью специальных приборов цитоспектрофотометров. Они регистрируют спектры поглощения или излучения участков цитологического препарата и по их интенсивности судят о количественном содержании исследуемых веществ.

Микроскопия (лат. μΙκροσ — мелкий, маленький и σκοποσ — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, рентгеновская или рентгеновская лазерная микроскопия, отличающиеся использованием электромагнитных лучей с возможностью рассмотрения и получения изображений микроэлементов вещества в зависимости от разрешающей способности приборов ().

Оптическая микроскопия. Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов.

Оптический, или световой микроскоп использует видимый свет, проходящий через прозрачные объекты, или отражённый от непрозрачных. Оптическая система из нескольких линз позволяет получить кажущееся увеличенное изображение образца. Полученное изображение можно наблюдать глазом (или обеими глазами, в бинокуляре), либо фотографировать, передавать на видеокамеру для оцифровки. В состав современного микроскопа обычно входит система подсветки, столик для перемещения объекта (препарата), наборы специальных объективов и окуляров.

Были разработаны виды микроскопов, порзволяющие существенно расширить возможности обычной оптической микроскопии:

До 1950-х годов работали преимущественно в диапазоне видимого спектра света. Глаз работает в оптическом диапазоне длин волн. Оптические микроскопы не могли давать разрешающей способности менее полупериода волны опорного излучения (для видимого диапазона длина волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм). Предельное увеличение оптического микроскопа — до 2000 раз. Дальнейшее увеличение изображения нецелесообразно, так как не позволяло обнаружить дополнительных деталей структуры вешества. Отдельные частички размером приблизительно до 0,15 мкм хорошо видны при увеличении в 2000 раз. Более мелкие частицы не отражают световые лучи и не видны под микроскопом.

Совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др.) с помощью электронных микроскопов - приборов, в которых для получения увеличения изображений используют электронный пучок. Электронная микроскопиявключает также методики подготовки изучаемых объектов, обработки и анализа результирующей информации. Различают два главных направления электронной микроскопии: трансмиссионную (просвечивающую) и растровую (сканирующую), основанных на использовании соответствующих типов. Они дают качественно различную информацию об объекте исследования и часто применяются совместно. Известны также отражательная, эмиссионная, оже-электронная, лоренцова и иные виды электронной микроскопии, реализуемые, как правило, с помощью приставок к трансмиссионным и растровым электронным микроскопам.

Рентгеновская микроскопия — совокупность методов исследования микроскопического строения вещества с помощью рентгеновского излучения. В рентгеновской микроскопии используют специальные приборы — рентгеновские микроскопы. Разрешающая способность достигает 100 нм, что в 2 раза выше, чем у оптических микроскопов (200нм). Теоретически рентгеновская микроскопия позволяет достичь на 2 порядка лучшего разрешения, чем оптическая (поскольку длина волны рентгеновского излучения меньше на 2 порядка). Однако современный оптический микроскоп - наноскоп имеет разрешение до 3-10нм.

Рентгеновская микроскопия разделяется на:

Отражательная микроскопия
Проекционная микроскопия
Электронная микроскопия
Рентгеновская лазерная микроскопия

Гистологическая техника. Методы и техника микроскопирования

Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата.

¨ Задание:

1. Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.

Таблица 2

Методы и техника микроскопирования

1. Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой).

Различают:

Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами .

в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот методслужит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения.

г) Микроскопия в темном поле. Достигает объективатолько свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д.

д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.

е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

2. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдига – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц.

3. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

2. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним.

Работа с микроскопом . Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа.

С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив.

Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением.

Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость.

В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами.

Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения.

Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение.

Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований.

А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения.

3. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение.

Таблица 3

Препараты тканей с разным окрашиванием