Таблица антиоксидантной активности. Дипломная работа: Изучение антиоксидантной активности растений. Аскорбиновая кислота как антиоксидант

Изобретение предназначено для использования в биологии и медицине. Определяют активность супероксиддисмутазы и антиоксидантные свойства химических соединений по их способности ингибировать реакцию аутоокисления адреналина в щелочной среде. Скорость реакции оценивают спектрофотометрически по величине оптической плотности накапливающегося продукта аутоокисления адреналина, имеющего поглощение при длине волны 347 нм (волновое число 28,8), образующегося в отсутствии и присутствии исследуемых препаратов. Для проведения реакции аутоокисления 100 мкл 0,1% раствора адреналин гидрохлорида (готовая аптечная форма) добавляют в 2 мл 0,2 М карбонатного буфера. Анализируемую пробу перемешивают, помещают в спектрофотометр и измеряют величину оптической плотности в течение 3 мин при длине волны 347 нм относительно пробы без адреналина. Активность СОД и антиоксидантную активность исследуемых химические соединений оценивают по степени ингибирования скорости реакции аутоокисления адреналина в присутствии исследуемых препаратов относительно контрольной пробы (их отсутствие). Изобретение обеспечивает значительную простоту, экспрессивность, доступность химических реактивов для определения антиоксидантных свойств биохимических препаратов и химических соединений. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 7 ил.

Изобретение относится к области аналитической биохимии, в частности к клинической медицинской биохимии и фармакологии. Оно может быть использовано в биологии и медицине при исследованиях с целью оценки антиоксидантных свойств биологического материала и различных химических соединений, претендующих на роль антиоксидантов. Подобная оценка крайне необходима, поскольку нужно контролировать ситуации, связанные с образованием активных форм кислорода в условиях окислительного стресса и индентифицировать антиоксидантные свойства химических соединений, используемых для антиоксидантной зашиты, что крайне важно в сложной экологической обстановке сегодняшнего дня. Кроме того, в медицинской практике для установления диагноза, наблюдения за процессом лечения и характером течения болезни (обострение, стадия ремиссии) важно контролировать состояние системы антиоксидантной защиты организма. Для выявления антиоксидантного статуса организма определяют активность первого, стоящего на страже защиты от супероксидных радикалов фермента, супероксиддисмутазы - СОД (КФ 1.15.1.1.), катализирующей реакцию дисмутации, в результате которой происходит превращение высокореакционного аниона радикала кислорода (супероксид аниона, O - 2 ) в относительно менее активную перекись водорода и молекулярный кислород O - 2 + O - 2 + 2H + = H 2 O 2 + O 2 По величине активности этого фермента (наряду с другими последующими ферментами - глютатионпероксидазой и каталазой, - инактивирующими уже продукт реакции СОД - перекись водорода) можно судить об антиоксидантном статусе ткани или организма в целом. Активность СОД определяют часто в гемолизате эритроцитов, поскольку именно в эритроцитах имеется мощная антиоксидантная защитная система. Величина активности фермента характеризует его способность утилизировать образующиеся супероксидные радикалы, что дает информацию о состоянии системы антиоксидантной защиты организма как в физиологических условиях, так и в условиях патологического процесса. Известен способ измерения активности СОД, основанный на ее способности тормозить аутоокисление адреналина в щелочной среде: 1. Me Cord J.M., Fridovich I. / J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244, N 22. - P. 6049-6055. 2. Misra H.P., Fridovich 1. / J. Biol. Chem. -1972.- Vol. 247, N 10. - P.3170-3175. Аутоокисление адреналина, попадающего в щелочную среду, инициируется супероксидными радикалами, возникающими в результате внутримолекулярных перестроек адреналина в ходе его превращения через адреналинхинон в адренохром. Фермент СОД, перехватывая супероксидные радикалы, ингибирует образование адренохрома. Этот подход авторы используют как способ оценки активности фермента . В соответствии с предлагаемым способом по количеству адренохрома, продукта аутоокисления адреналина в щелочной среде, имеющего максимум поглощения в области 480 нм, оценивают активность препаратов, содержащих СОД. Измерение количества образующегося адренохрома проводят на спектрофотометре при длине волны 480 нм (волновое число 20,8) в 0.05 М карбонатном буфере, pH 10,1 или 10,2, при температуре 25 - 30 o C и концентрации адреналина от 200 до 600 мкМ. Так как спонтанные реакции дисмутации протекают обычно медленно и стационарные концентрации супероксида, которые могут быть в такой химической реакции, низкие, то для выявления эффективность работы СОД в исследуемую систему вносят дополнительный источник генерации супероксидных анионов. В качестве такого источника O - 2 авторы использовали ферментативную систему ксантин-ксантиноксидаза. Недостатки этого метода: невысокая скорость реакции (даже в присутствии ксантин-ксантиноксидазы прирост величины оптической плотности конечного продукта окисления адреналина составляет 0,005-0.026 опт.ед./мин); необходимо термостатирование образцов (25 - 30 o C) и требуются дорогие коммерческие препараты (ксантин, адреналин, ферменты ксантиноксидаза и СОД). Наиболее близким к предлагаемому способу по набору технических средств является метод, который используют Симонян М.А., Набалдян P.M. (Биохимия. - 1975. - Т. 40, вып. 4., с. 726-734) . Способ основан также на реакции аутоокислении адреналина в щелочной среде и является модификацией метода . Определение адренохрома проводят не применяя дополнительных источников генерации супероксида, однако, чтобы измерить достаточное количество образовавшегося адренохрома в реакционную среду вносят высокую концентрацию адреналина - 1 мМ (т.е. для приготовления рабочего 0,01М раствора адреналина необходимо иметь коммерческий сухой препарат). Измерение проводят также при температуре выше комнатной (25 o C), в 0.2 М карбонатном буфере, pH 10,2, используя длину волны 490 нм. Недостатки метода: необходима высокая концентрация адреналина в пробе и, следовательно, требуется коммерческий препарат адреналина, измерение проводят при термостатировании образцов. Известны и другие способы определения СОД, которые имеют более высокую чувствительность в сравнении с "адренохромными" методами , однако методы трудоемкие, скорости реакции невысокие (0.015 оп. ед. /мин или 0.0065-0.044 оп. ед./мин ), измерения проводят при термостатировании образцов и требуются дорогие коммерческие препараты, такие как: нитросиний тетрозолий (НСТ), цитохром C и ксантин-ксантиноксидаза или НАДН- феназинметасульфат (НАДН-ФМС) . 3. Beauchamp C., Fridovich I. / Analytic. Biochem. - 1971. - Vol. 44. - P. 276-287., 4. Nishikimi N., Rao N.A., Yagi K. / Bioch. Bioph. Res. Commun.- 1972.- Vol. 46, N 2.- C.849-854.] Таким образом, как описано выше, известные методы определения активности фермента СОД требуют дорогих химических реактивов, таких как: ксантин и ксантиноксидаза или НАДН и ФМС, нитросиний тетрозолий или цитохром C, коммерческий препарат СОД, высокие концентрации адреналина. Реакцию проводят при температуре 25-30 o C, т.е. необходимо термостатирование образцов. Задачей настоящего изобретения является создание более простого способа определения антиоксидантной активности СОД и расширение его возможностей для использования как тест-системы при оценке антиоксидантных свойств биологических материалов (гемолизаты эритроцитов крови) и различных химических соединений за счет применения абсолютно доступных недорогих химические реактивов при сохранении высокой чувствительности. Решение поставленной задачи достигается тем, что в известном способе определения антиоксидантной активности СОД по реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде проводят по накоплению продукта его окисления - адренохрому, имеющего поглощение при 480 нм, согласно предлагаемому способу активность СОД и оценку антиоксиданных свойств химических соединений проводят по ранее образующемуся новому продукту аутокисления адреналина, имеющему поглощение при 347 нм. Накопление этого соединения, достаточного для количественной оценки, происходит в течение 1-3 мин от момента добавления в щелочной раствор низких концентраций адреналина (230 мкМ), что позволяет использовать готовую аптечную форму 0.1% раствора адреналин гидрохлорида. Его вносят в 0,2 М карбонатный буфер, pH 10,65, при комнатной температуре (не ниже 15 o C), в отсутствии дополнительных источников генерации супероксидных радикалов и измеряют поглощение при 347 нм через 3 мин. Опытным путем было установлено, что коммерческий препарат СОД, гемолизат эритроцитов, известные антиоксиданты (аскорбат, цистеин) способны ингибировать процесс накопления этого соединения, что позволяет использовать этот способ измерения как тест-систему для экспресс оценки антиоксидантных свойств различных препаратов и химических соединений. Существенным преимуществом предлагаемого подхода является возможность использования легко доступных, недорогих химических реактивов: 0.1% аптечного раствора гидрохлорид адреналина и 0.2 М карбонатного буфера, pH 10.65. В доступных источниках научно-технической и патентной информации, включая просмотр базы данных Medline и PubMed, журналы "Изобретения РФ", патентная база данных США (1976-1999 г.г.), "Изобретения стран мира", тематическая подборка вып. 84, N 1-24 и вып. 8 N 1-24, не выявлены сведения об определении активности СОД, основанные на измерении продукта реакции аутоокисления адреналина, поглощающего при 347 нм. Поэтому предлагаемое техническое решение способа обладает новизной и соответствует критерию патентоспособности "изобретательский уровень". Способ определения антиоксидантной активности (активности СОД) в соответствии с изобретением осуществляется следующим образом. В спектрофотометрическую кювету к 2 мл карбонатного буфера, pH 10,65, при комнатной температуре (не ниже 15 o C), добавляют 100 мкл 0.1% раствора адреналина (230 мкМ). Происходит быстрое (в течение нескольких минут) аутоокисление адреналина, которое регистрируют не по образованию адренохрома, а по ранее появляющемуся продукту окисления адреналина, поглощающему при длине волны 347 нм (волновое число 28,8). Образование этого продукта ингибируется СОД. Прирост величины оптической плотности накопления этого соединения составляет 0,025-0.1 оп.ед./мин. В течение указанного времени образование адренохрома еще не наблюдается: нет поглощения при 480 нм. В этом состоит ПРИНЦИПИАЛЬНОЕ отличие предлагаемого способа в сравнении с известными. Благодаря обнаруженному СОД-чувствительному процессу аутоокисления адреналина с образованием продукта, поглощающего при 347 нм и опережающего по времени и скорости накопление адренохрома, появилась возможность быстро, в течение 3-5 мин (время на постановку одной пробы) определять интенсивность процесса аутоокисления адреналина в отсутствии СОД-содержащих препаратов или антиоксидантов (контроль) и в их присутствии (исследуется ингибирующее действие СОД или антиоксидантов относительно контроля). Рассчитывая процент ингибирования аутоокисления адреналина в сравнении с контрольной пробой, можно количественно оценить антиоксидантную эффективность исследуемых биологических препаратов или химических соединений. Этот подход дает возможность добавлять низкие (230 мкМ) концентрации адреналина, что позволяет использовать готовую форму аптечного препарата 0.1% раствора адреналин гидрохлорида и исключает применение дополнительных источников генерации O - 2 . Предлагаемое решение дает высокий экономический эффект, поскольку не нужны дорогостоящие импортные коммерческие препараты. На фиг. 1 представлены спектры поглощения адреналина (2.310 -4 М) в воде (A) и 0.2 М карбонатном буфере pH 10,65 (Б). Показано, что при добавлении адреналина в щелочную среду (pH 10.65) наблюдается сдвиг максимума поглощения в УФ-области (280 нм) и появление поглощения при 330-350 нм, которое увеличивается во времени (фиг. 1, Б). Наблюдая за процессом аутоокисления адреналина в щелочной среде, постоянно регистрируя весь спектр в течение 10-15 мин, была выявлена динамика спектральных изменений при 347 нм. На фиг. 2 представлена динамика реакции аутоокисления адреналина в карбонатном буфере, pH 10,65, измеряемая при длине волны 347 нм (приведены результаты двух параллельных измерений). Таким образом установлено, что о скорости реакции аутоокисления адреналина можно судить по изменению оптической плотности при этой длине волны за промежуток времени не менее 1 - 3 мин. Все измерения проводили при комнатной температуре (от 15 -17 o C в осенне-зимний период и от 22 o C и иногда выше в летний период), т.е. не термостатируя образцы. В этих условиях при используемой концентрации адреналина образования адренохрома (поглощение при длине волны 480 нм), как это видно из фиг. 1, Б, не наблюдается. Очевидно, что для образования адренохрома необходима интенсификация скорости аутоокисления адреналина, которая может быть обеспечена разными факторами, такими как: 1. Более высокая температура, чем в наших условиях (что имеет место в аналоге и прототипе ), или 2. Более высокая концентрация адреналина (что имеет место в прототипе ), или 3. Использование любого известного окислителя, который также мог бы ускорить аутоокисление адреналина (например, FeSO 4 или более сильный окислитель (K 3 {Fe(CN) 6). Так показано, что в присутствии ионов двухвалентного железа (50 мкМ FeSO 4) наблюдается и появление пика поглощения адренохрома. Важно, что с появлением поглощения в области 480 нм, амплитуда пика при 347 нм не уменьшается и что амплитуда пика при 347 нм значительно больше, чем амплитуда пика при 480 нм (см. табл. 1). Все исследования, в отличие от прототипа и аналога, проводили при pH 10,65. На фиг. 3 представлены данные по влиянию различных величин pH 0.2 М карбонатного буфера на ход реакции аутоокисления адреналина, измерение проведено при длине волны 347 нм (1 - 10.65; 2 - 10.55; 3 - 10.45; 4 - 10.3; 5 - 10.2). Наиболее интенсивно процесс окисления адреналина происходит в карбонатном буфере при pH10,65; при более низких значения pH скорость реакции аутоокисления адреналина существенно ослабевает. Данные, представленные на фиг. 4, показывают, что накопление продукта, имеющего поглощение при 347 нм, чувствительно к ферменту СОД: коммерческий препарата СОД ("Serva", Германия) ингибирует процесс аутоокисления адреналина. Бычий сывороточный альбумин (BSA), используемый как контроль, подобного действия не оказывает (фиг. 4 - Действие различных концентраций СОД и BSA на аутоокисление адреналина: О - контроль; - 100 нг/мл СОД; - 600 нг/мл СОД; - 800 нг/мл СОД; - 500 нг/мл BSA; - 1 мкг/мл BSA). Гемолизат эритроцитов, содержащий фермент СОД, также ингибирует аутоокисление адреналина. На фиг. 5 показано ингибирующее действие гемолизата эритроцитов крови пациента на процесс аутоокисления адреналина: - контроль; O - в присутствии гемолизата эритроцитов. Приведены результаты трех параллельных измерений. Было проведено исследование некоторых соединений, которые могут быть ловушками активных форм кислорода, выступая, таким образом, в роли антиоксидантов. На фиг. 6 показано ингибирующее действие микромолярных концентраций аскорбиной кислоты на процесс аутоокисления адреналина: - контроль, О - 5 мкМ, - 25 мкМ. На фиг. 7 представлены данные по исследованию влияния различных концентраций цистеина на реакцию аутоокисления адреналина: 1 - контроль (данные трех параллельных измерений), 2 - 2.5 мкМ, 3 - 5 мкМ, 4 - 25 мкМ. Проверено, что добавление тестируемых соединений в 0.2 М карбонатный буфер не изменяет его величины pH. Полученные результаты показывают, что предлагаемый способ можно использовать как тест-систему для исследования эффективности действия различных антиоксидантов. Таким образом, положительный эффект предлагаемого изобретения заключается в том, что разработанный способ измерения антиоксидантной активности биологических материалов (гемолизат эритроцитов) и различных химических соединений (аскорбат и цистеин), основанный на их способности ингибировать реакцию аутоокисления адреналина, об интенсивности который судят, в отличии от прототипа и аналогов, не по накоплению адренохрома в щелочной среде, поглощающего при длине волны 480-490 нм, который еще не образуется в этих условиях, поскольку используются низкие концентрации адреналина (230 мкМ), невысокая комнатная температура (15-20 o C) и отсутствуют дополнительные источники генерации супероксидных радикалов, а по накоплению нового, ранее образующемуся продукту окисления адреналина - поглощение при 347 нм -, что позволяет применить готовый аптечный 0.1% раствор адреналина и проводить исследования при указанных ниже условиях. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения. Пример 1. Определение активности СОД эритроцитов крови пациентов. А) Процедура проведения реакции аутоокисления адреналина. В спектрофотометрическую кювету с 2 мл 0.2 М карбонатного буфера, pH 10.65, добавляют 100 мкл 0,1% аптечного раствора препарата адреналина, тщательно и быстро перемешивают, помещают в спектрофотометр и измеряют величину оптической плотности при длине волны 347 нм (волновое число 28.8) через 15, 30 секунд в течение 3-5 мин. Б) Определение активности СОД. При работе с биологическими препаратами - гемолизаты эритроцитов крови - в кювету к буферу добавляют исследуемый препарат и затем вносят раствор адреналина, перемешивают и измеряют нарастание оптической плотности. В контрольную пробу, против которой проводится измерение, также добавляют такое же количество препарата, но не вносится адреналин. Согласно описанной выше процедуре, определяют величину активности СОД в гемолизате эритроцитов пациентов: к 2 мл карбонатного буфера добавляют 10 мкл исследуемого препарата гемолизата и 100 мкл 0.1% аптечного раствора адреналина. Тщательно, быстро перемешивают, закрыв кювету крышечкой от спектральной кюветы, и регистрируют нарастание оптической плотности при 347 нм в течение 3-5 минут против контрольного раствора: те же компоненты, но без адреналина. Гемолизат эритроцитов, как источник СОД получают общепринятым методом: берут 100 мкл крови из пальца пациента и помещают ее в 900 мкл 10% цитрата натрия; центрифугированием отделяют осадок эритроцитов, дважды промывают его 1 мл физиологического раствора, избегая грубых механических воздействий, и обрабатывают 0.3% раствором NaCl, содержащим 0.02% сапонина, в соотношении 1 объем взвеси эритроцитов и 2 объема раствора, в течение 15 мин при 4 o C. На фиг. 5 показано ингибирующее действие гемолизата эритроцитов одного из пациента на реакцию аутоокисления адреналина: контроль, О - в присутствии гемолизата эритроцитов (данные трех параллельных измерений). На графике отмечено: D контр - изменение величины оптической плотности при 347 нм через 3 мин от начала регистрации процесса окисления адреналина (контроль), D опыт - то же, в присутствии гемолизата эритроцитов (опыт). Для построения графиков используют компьютерные программы "Гарвардская графика" или "Sigma plot". При построении графиков учитывают количество биологического материала, вносимого в исследуемую пробу. Его оценка проводится путем измерения оптической плотности при 280 нм 10 мкл гемолизата, добавленного в 2 мл физиологического раствора. Величина оптической плотности гемолизата колеблется в диапазоне 0.11-0.18 ед.опт.плотности. О скорости окисления адреналина судят по изменению оптической плотности, измеренной при 347 нм за 3 мин. Величину активности СОД в гемолизатах эритроцитов пациентов оценивают по степени ингибирования гемолизатом скорости аутоокисления адреналина. Процент ингибирования вычисляют по формуле: {1-(D опыт /D контроль)}100%,
где D опыт и D контроль - скорости реакции аутоокисления адреналина, соответственно, в присутствии и отсутствии гемолизата эритроцитов. Активность СОД выражают в условных единицах. За 1 условную единицу принимают 1% ингибирования. Активность фермента в условных единицах рассчитывают на 0.1 ед. оптической плотности при 280 нм (удельная активность фермента). В табл. 2 представлены данные расчета активности СОД конкретного эксперимента (фиг. 5). С помощью предлагаемого способа определена активность СОД гемолизата эритроцитов 20 пациентов-добровольцев клинического центра "Моран" г. Пущино Московской области. Установлено, наличие индивидуальных изменений активности СОД в зависимости от состояния пациентов (клинический анализ крови). Средняя величина активности СОД условно контрольной группы, измеренная согласно изобретению, составляла 657 условных единиц. Пример 2. Определение антиоксидантной активности химических препаратов. Измерения антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты и цистеина проводили как описано в разделе "Процедура проведения реакции аутоокисления адреналина". Эти соединения известны как ингибиторы образования свободных радикалов, выступая, таким образом, в роли антиоксидантов. На фиг. 6 и 7 иллюстрируется ход реакции аутоокисления в контрольной пробе и в присутствии исследуемых химических соединений. Показано ингибирующее действие микромолярных концентраций аскорбиновой кислоты (фиг. 6) и цистеина (фиг. 7) на процесс аутоокисления адреналина. Предлагаемое изобретение, таким образом, позволяет оценить антиоксидантную (синоним: антиокислительную) активность химических соединений и дать рекомендации по их использованию. Вывод. Предлагаемый способ дает возможность определить активность СОД в биологическом материале (гемолизат эритроцитов) и наличие антиоксидантной активности химических соединений благодаря тому, что, как установлено, за процессом аутоокисления адреналина можно следить не по накоплению адренохрома, а по ранее появляющемуся продукту его окисления, образование которого также чувствительно к СОД. Для проведения реакции не требуется добавления высоких концентраций адреналина в щелочную среду, как это описано в прототипе , и применение дополнительных источников генерации супероксидных радикалов, как это описано в аналогах , что позволяет обойтись без дорогостоящих импортных реактивов. Способ определения антиоксидантной активности супероксиддисмутазы и химических соединений
Перечень фигур
Фиг. 1. Спектры поглощения адреналина (2,6 10 -4 М) в воде (А) и 0.2 М карбонатном буфере, pH 10,65 (Б) во времени: 1 - 30 сек, 2 - 1 мин, 3 - 2.5 мин, 4 - 4.5 мин, 5 - 6 мин. Фиг.2. Динамика реакции аутоокисления адреналина (2.6 10 -4 М) в карбонатном буфере, pH 10,65, измеряемая при длине волны 347 нм. Приведены данные двух параллельных измерений. Фиг. 3. Влияние различных величин pH 0.2 М карбонатного буфера на ход реакции аутоокисления адреналина. Измерение проведено при длине волны 347 нм. Величины pH: 1 - 10,65; 2 - 10,55; 3 - 10,45; 4 - 10,3; 5- 10,2. Фиг. 4. Действие различных концентраций супероксиддисмутазы (СОД) и бычьего сывороточного альбумина (BSA) на аутоокисление адреналина: О - контроль; нг/мл СОД; - 600 нг/мл СОД; - 800 нг/мл СОД; - 500 нг/мл BSA; - 1 мкг/мл BSA. Фиг. 5. Ингибирование аутоокисления адреналина гемолизатом эритроцитов крови человека: - контроль, О - в присутствии гемолизата эритроцитов. Приведены данные трех параллельных измерений. Фиг. 6. Влияние аскорбиновой кислоты на аутоокисление адреналина. - контроль; О - 5 мкМ; - 25мкМ. Фиг. 7. Влияние цистеина на процесс аутоокисления адреналина: 1 - контроль; 2 - 2,5 мкМ; 3 - 5 мкМ; 4 - 25 мкМ. Источники информации
1. Me Cord J.M., Fridovich I. / J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244, N 22. - P. 6049-6055. 2. Misra H.P., Fridovich I. / J. Biol. Chem. -1972.- Vol. 247, N 10. - P.3170-3175. 3. Симонян M. A., Набалдян P.M. (Биохимия. - 1975. - Т. 40, вып. 4. С. 726-734). 4. Beauchamp C., Fridovich 1. / Analytic. Biochem. - 1971. - Vol. 44. - P. 276-287. 5. Nishikimi N., Rao N.A., Yagi K. / Bioch. Bioph. Res. Commun. - 1972.- Vol. 46, N2.- C.849-854.].

Для измерения антиоксидантной ак-

тивности (АА) используют разные хи-

мические и физико-химические методы, чаще всего основанные на прямом или косвенном измерении скорости или полноты реакции.

Можно выделить три типа методов, основанных на следующих измерениях:потребление

кислорода;образование продуктов окисления;поглощение (или связывание) свободных радикалов.

Основные методы:

ORAC - oxygen radical absorbance

TRAP - total radical trapping antioxidant

FRAP - ferric reducing antioxidant

TEAC - (Randox) - trolox equivalent

antioxidant capacity;

ABTS - - azinobis (3-ethylbenzthiazoline)-

6-sulfonic acid;

TBARS - thiobarbituric acid reactive

В этих методах антиоксидантная

активность является функцией мно-

гих параметров, в частности времени,

температуры, природы вещества, кон-

центрации антиоксиданта и других со-

единений. Недостатком многих методов из-

мерения антиоксидантной активности

является отсутствие истинных суб-

стратов в процессе измерения. Чаще

всего измеряется антиоксидантная ак-

тивность к свободным синтетическим

долгоживущим радикалам (ABTS,

DPPH, AAPH и др.)

19. Определение антиоксидантной активности на приборе Цвет-Яуза аа-01. Методы определение степени окисления липидов.

Основные природные антиоксиданты - флавоноиды, ароматические гидрооксикислоты, антоцианы, витамины С и Е, каротиноиды и др. Исключительное значение имеют антоцианы, так как благодаря заряду на атоме кислорода в кольце антоцианидины и антоцианины легче проникают через мембраны клеток.Цвет Яуза-АА-01

предназначенный для прямого количественного измерения содержания антиоксидантов в пробах анализируемых продуктов и напитков. Функциональная схема прибора включает емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового

крана, амперометрический детектор, представляющийсобой термостатируемую электрохимическую ячейку со сменными рабочими электродами, усилитель тока, аналого-

цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала. Амперометрический детектор может

функционировать в трех режимах: при постоянном потенциале, при импульсных потенциалах и при сканировании

потенциалов во всем диапазоне. Варьируя полярность электродов и величины приложенных потенциалов, можно определять не только суммарную антиоксидантную актив-

ность, но и активность отдельных классов биологических соединений.

27. Масспектрометрия. Применение в пищевой промышленности. Разработка новых лекарственных средств для спасения человека от ранее неизлечимых болезней и контроль производства лекарств, генная инженерия и биохимия, протеомика. Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ.Выяснение источника происхождения очень важно для решения целого ряда вопросов: например, определение происхождения взрывчатых веществ помогает найти террористов, наркотиков - бороться с их распространением и перекрывать пути их трафика. Экономическая безопасность страны более надёжна, если таможенные службы могут не только подтверждать анализами в сомнительных случаях страну происхождения товара, но и его соответствие заявленному виду и качеству. А анализнефтиинефтепродуктовнужен не только для оптимизации процессов переработки нефти или геологам для поиска новых нефтяных полей, но и для того, чтобы определить виновных в разливах нефтяных пятен в океане или на земле.В эпоху «химизации сельского хозяйства» весьмаважным стал вопрос о присутствии следовых количеств применяемых химических средств (например, пестицидов) в пищевых продуктах. В мизерных количествах эти вещества могут нанести непоправимый вред здоровью человека.Целый ряд техногенных (то есть не существующих в природе, а появившихся в результате индустриальной деятельности человека) веществ являются супертоксикантами (имеющими отравляющее, канцерогенное или вредное для здоровья человека действие в предельно низких концентрациях). Примером является хорошо известныйдиоксин.Существование ядерной энергетики немыслимо без масс-спектрометрии. С её помощью определяется степень обогащения расщепляющихся материалов и их чистота.Конечно и медицина не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия углеродных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфицированности человекаHelicobacter pyloriи является самым надёжным из всех методов диагностики. Также, масс-спектрометрия применяется для определения наличиядопингав крови спортсменов.Трудно представить область человеческой деятельности, где не нашлось бы места масс-спектрометрии. Ограничимся просто перечислением:аналитическая химия,биохимия,клиническая химия,общая химияиорганическая химия,фармацевтика,косметика,парфюмерия,пищевая промышленность,химический синтез,нефтехимияинефтепераработка,контроль окружающей среды,производство полимеров и пластиков,медицинаитоксикология,криминалистика,допинговый контроль,контроль наркотических средств,контроль алкогольных напитков,геохимия,геология,гидрология,петрография,минералогия,геохронология,археология,ядерная промышленностьиэнергетика,полупроводниковая промышленность,металлургия.методисследованиявеществапутём определения отношениямассыкзаряду(качества) и количества заряженных частиц, образующихся при том или ином процессе воздействия навещество(см.:ионизация). История масс-спектрометрии ведётся с основополагающих опытовДжона Томсонав начале XX века. Окончание «-метрия» термин получил после повсеместного перехода от детектирования заряженных частиц при помощи фотопластинок к электрическимизмерениямионных токов.Существенное отличие масс-спектрометрии от другиханалитическихфизико-химическихметодов состоит в том, чтооптические,рентгеновскиеи некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия непосредственно детектирует сами частицы вещества.Масс-спектрометрия в широком смысле - этонаукаполучения иинтерпретациимасс-спектров, которые в свою очередь получаются при помощи масс-спектрометров .Масс-спектрометр - это вакуумныйприбор, использующий физические законы движения заряженных частиц в магнитных и электрических полях, и необходимый для получения масс-спектра.

ГОСТ Р 54037-2010

Группа Н09

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение содержания водорастворимых антиоксидантов амперометрическим методом в овощах, фруктах, продуктах их переработки, алкогольных и безалкогольных напитках

Foodstuffs. Determination of water-soluble antioxidants content by amperometric method in vegetables, fruits, products of their processing, alcoholic and soft drinks

ОКС 67.080
67.160.10

67.160.20
ОКСТУ 9109

Дата введения 2012-01-01

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании" , а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский институт физико-технических и радиотехнических измерений" Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии (ФГУП "ВНИИФТРИ")

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. N 651-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на овощи, фрукты, продукты их переработки, алкогольные и безалкогольные напитки и устанавливает амперометрический метод определения содержания водорастворимых антиоксидантов (по общей антиоксидантной активности) в диапазоне от 0,2 до 4,0 мг/дм включительно.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51144-2009 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 * Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
______________
* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 , здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6687.0-86 Продукция безалкогольной промышленности. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12786-80 Пиво. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 антиоксиданты: Вещества, прерывающие радикально-цепные процессы окисления в объектах органического и неорганического происхождения.

4 Сущность метода

Амперометрический метод заключается в измерении силы электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале и сравнении полученного сигнала с сигналом от стандарта (кверцетина) при тех же условиях измерения.

5 Средства измерений, оборудование, реактивы, материалы

5.1 Анализатор амперометрический проточный (далее - прибор) со специальным программным обеспечением для сбора и обработки данных, например "Цвет Яуза-01-АА".

5.2 Весы лабораторные специального класса точности по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,2 мг.

5.3 Гомогенизатор - мельница типа "Циклотек" или аналог.

5.4 Центрифуга лабораторная настольная с частотой вращения до 3000 об/мин.

5.5 Колбы мерные 1-10, 1-50, 1-250, 1-1000 по ГОСТ 1770 .

5.6 Дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема 5-50 мм и 100-1000 мм с погрешностью измерения не более 5%.

5.7 Шприц медицинский вместимостью 1 см или одноразовый по ГОСТ 22967 .

5.8 Стаканчики для взвешивания типа СВ 24/10 вместимостью 24 см по ГОСТ 25336 .

5.9 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026 .

5.10 Воронка стеклянная химическая по ГОСТ 25336 .

5.11 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .

5.12 Бидистиллированная вода.

5.13 Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552 , ч.д.а. или х.ч.

5.14 Спирт этиловый ректифицированный из пищевого сырья по ГОСТ Р 51652 .

5.15 Кверцетин. ч.д.а.

5.16 Натрия гидроокись, ч.д.а. по ГОСТ 4328 .

5.17 Хромовая смесь для мытья посуды, приготовленная по ГОСТ 4517 .

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также других реактивов и материалов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

6 Подготовка к выполнению измерений

6.1 Отбор проб

Отбор проб пищевых продуктов проводят в соответствии с требованиями стандартов на отдельные виды пищевых продуктов и продовольственного сырья, например, проб пива по ГОСТ 12786 , проб продуктов безалкогольной промышленности по ГОСТ 6687.0 , проб продуктов переработки плодов и овощей по ГОСТ 26313 , проб продуктов винодельческой промышленности по ГОСТ Р 51144 .

6.2 Подготовка лабораторной посуды

Новую и загрязненную стеклянную посуду тщательно промывают раствором хромовой смеси, после чего многократно ополаскивают сначала водопроводной, а затем несколько раз дистиллированной водой. Окончательно посуду трижды ополаскивают бидистиллированной водой.

6.3 Приготовление растворов

6.3.1 Приготовление элюента (раствора ортофосфорной кислоты молярной концентрацией 2,2 ммоль/дм )

В мерную колбу вместимостью 1000 см наливают приблизительно 700 см бидистиллированной воды, добавляют пипеточным дозатором 0,15 мм концентрированной ортофосфорной кислоты и 10,0 см 96%-ного этилового спирта, полученный раствор доводят до метки бидистиллированной водой. Тщательно перемешивают.

Срок хранения в вытяжном шкафу в колбе с притертой пробкой - 1 мес.

6.3.2 Приготовление гидроокиси натрия концентрацией 0,1 моль/дм

Навеску гидроокиси натрия массой 1,0 г растворяют не содержащей углекислого газа дистиллированной водой и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

6.3.3 Приготовление растворов кверцетина

6.3.3.1 Приготовление исходного раствора кверцетина концентрацией 100 мг/дм

В стаканчике для взвешивания отвешивают (20,0±0,1) мг кверцетина, добавляют 6,0 см раствора гидроокиси натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм по 6.3.2. Перемешивают до полного растворения. После растворения кверцетина содержимое стаканчика количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 см и объем раствора доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора в холодильнике - 1 мес.

6.3.3.2 Приготовление градуировочных растворов кверцетина концентрацией 0,2; 0,5; 1,0 и 4,0 мг/дм

В мерные колбы вместимостью 10 см пипеточным дозатором вводят соответственно 0,02, 0,05, 0,1 и 0,4 см раствора кверцетина по 6.3.3.1, доводят до метки элюентом.

Градуировочные растворы кверцетина готовят каждый раз при построении градуировочных характеристик.

6.4 Подготовка проб

6.4.1 Из жидких проб, отобранных по 6.1, готовят две параллельные пробы по 10 см продукта.

6.4.2 Из подготовленных по 6.4.1 проб отбирают по 1 см и доводят элюентом до 10 см.

6.4.3 Подготовленную по 6.4.2 пробу фильтруют через бумажный фильтр.

6.4.4 Твердую пробу, отобранную по 6.1, измельчают и гомогенизируют.

В химический стакан вместимостью 150 см вносят навеску гомогената массой 1,0 г, доводят элюентом до 100 см и тщательно перемешивают.

6.4.5 Раствор переносят в конические центрифужные пробирки и центрифугируют со скоростью 3000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают, делят на две параллельные пробы и используют для анализа.

При массовой концентрации антиоксидантов в пробе, превышающей диапазон измерений (4 мг/дм), пробу кратно разбавляют элюентом.

6.5 Подготовка прибора к работе

Установку, включение и подготовку анализатора и регистрирующего устройства осуществляют в соответствии с руководством по эксплуатации.

Устанавливают рабочий потенциал, равный плюс 1,3 В.

Скорость подачи элюента устанавливают в соответствии с рекомендациями изготовителя прибора.

6.6 Градуировка прибора

6.6.1 Градуировочные растворы кверцетина (см. 6.3.3.2) последовательно, начиная с градуировочного раствора минимальной концентрации, вводят в прибор. Для этого шприц вместимостью 1 см промывают не менее трех раз, полностью заполняя его бидистиллированной водой, а затем однократно соответствующим градуировочным раствором. Заполняют шприц градуировочным раствором и промывают дозировочную петлю этим раствором не менее трех раз.

6.6.2 По окончании операции по 6.6.1 дозируют градуировочный раствор в поток элюента и, используя программное обеспечение, регистрируют выходной сигнал анализатора (площадь выходной кривой).

6.6.3 Каждый градуировочный раствор вводят пять раз и, используя программное обеспечение к анализатору, вычисляют среднеарифметическое значение выходного сигнала анализатора и относительное среднеквадратическое отклонение. Если относительное среднеквадратическое отклонение не превышает 5%, то за значение выходного сигнала анализатора, соответствующее данному градуировочному раствору, принимают среднеарифметическое значение. В случае обнаружения отклонения результатов измерения концентраций кверцетина более чем на 5% готовят свежие градуировочные растворы кверцетина и градуировку прибора по 6.6 проводят заново.

6.6.4 Устанавливают градуировочную характеристику анализатора в виде линейной зависимости среднеарифметических значений выходного сигнала (см. 6.6.3) от массовой концентрации кверцетина. Градуировочная характеристика признается приемлемой, если корреляции не ниже 0,99.

6.6.5 Стабильность градуировочной характеристики проверяют перед началом работ в день выполнения измерений. С этой целью один из свежеприготовленных градуировочных растворов кверцетина (см. 6.3.3.2) дозируют в анализатор не менее пяти раз, измеряют выходной сигнал и рассчитывают его среднеарифметическое значение для последовательных вводов (см. 6.6.1-6.6.3). Используя установленную ранее градуировочную характеристику (см. 6.6.4), рассчитывают значение массовой концентрации кверцетина. Градуировочная характеристика признается стабильной, если найденное значение отличается от заданного не более чем на ±5%.

Если условие стабильности градуировочной характеристики не выполняется только для одного контрольного раствора, то заново готовят этот контрольный раствор и проводят повторные измерения. Результаты повторного контроля считают окончательными.

Если условие стабильности градуировочной характеристики не выполняется для двух и более контрольных растворов, то градуировку прибора по 6.6 проводят заново.

7 Выполнение измерений

Измерения суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов проводят согласно инструкции к данному типу приборов.

7.1 Проводят по пять последовательных измерений выходного сигнала анализатора для каждой подготовленной по 6.4 параллельной пробы анализируемого образца (при измерении каждый раз используют свежую порцию раствора) и, с помощью градуировочной характеристики по 6.6, вычисляют значение суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов (в пересчете на кверцетин) для каждого ввода. Вычисляют среднеарифметическое полученных значений и относительное стандартное отклонение. За результат измерений суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов (в пересчете на кверцетин) в подготовленной параллельной пробе принимают среднеарифметическое значение, если относительное стандартное отклонение не превышает 5%.

7.2 Если значение выходного сигнала анализатора выходит за диапазон градуировочной характеристики, то подготовленную пробу разбавляют элюентом и измеряют суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов (в пересчете на кверцетин) в разбавленной подготовленной пробе по 7.1.

7.3 Процедуры по 7.1 и 7.2 проводят для каждой из двух параллельных проб анализируемого образца. Расхождение между результатами измерений суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов (в пересчете на кверцетин) в подготовленных параллельных пробах не должно превышать значений предела повторяемости, указанного в 8.3. В этом случае за результат измерений массовой концентрации антиоксидантов (в пересчете на кверцетин) в подготовленной пробе анализируемого образца принимают среднеарифметическое полученных значений.

8 Обработка и контроль точности результатов измерений

8.1 Суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в анализируемой пробе , мг/дм, вычисляют по формуле

- кратность разбавления анализируемой пробы.

Суммарное содержание антиоксидантов в твердой пробе , мг/дм, вычисляют по формуле

где - суммарное содержание антиоксидантов (в пересчете на кверцетин), определенное с использованием градуировочной характеристики по 6.6.3, мг/дм;

- объем раствора (экстракта) анализируемой пробы, дм;

- кратность разбавления анализируемой пробы;

- навеска анализируемого вещества, мг.

8.2 Оформление результатов измерений

За окончательный результат измерений суммарного содержания определяемого антиоксиданта в пробе, с округлением третьего знака, принимают среднеарифметическое значение (, мг/дм, или , мг/г) из результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (см. 8.3). Результаты измерений суммарного содержания анализируемых антиоксидантов в продукте представляют в виде

где - граница абсолютной погрешности измерений, мг/г.

Значение вычисляют по формуле

где - границы относительной погрешности измерений суммарного содержания анализируемого антиоксиданта (см. таблицу 1).

8.3 Контроль точности результатов измерений

Контроль точности результатов измерений приведен в таблице 1.


Таблица 1 - Метрологические характеристики

8.4 Контроль показателей качества измерений

Контроль показателей качества измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6 (раздел 6) или .

9 Требования безопасности

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами. Электробезопасность при работе с электроустановками - по ГОСТ 12.1.019 .

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения.

Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021 .

Библиография

Электронный текст документа
подготовлен ЗАО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2011

Тестами данной группы оценивают способность антиоксиданта замедлять окисление субстрата. Но какой выбрать субстрат? Он может быть естественным (растительное масло, например) или искусственным - химическим веществом, окисление которого сопровождается цветной реакцией. Где определять активность антиоксиданта? Большинство тестов позволяет оценить активность in vitro, но есть тесты, направленные на определение активности in vivo. Наконец, на какой стадии процесса окисления субстрата оценивать тормозящее действие антиоксиданта, ранней или поздней? Разные ответы на эти три вопроса лежат в основе разнообразия тестов данной группы.

Самый распространенный метод состоит в измерении динамики снижения веса масла при его нагревании. Повышенная температура позволяет сократить время тестирования, так как она ускоряет не только пероксидацию липидов, но и испарение летучих продуктов этой пероксидации (короткоцепочечных углеводородов, альдегидов, кетонов), приводящее к постепенному снижению веса нагреваемого масла. В присутствии антиоксидантов снижение веса масла происходит менее интенсивно. В качестве субстратов используются животный жир, растительное масло, а также искусственный субстрат - метиллинолеат (метиловый эфир линолевой кислоты). Этим методом, например, показано, что экстракт ягод винограда, добавленный в рафинированное соевое масло, может вдвое замедлить потерю веса масла при нагревании.

Более чувствителен метод PV (peroxide value), основанный на определении пе- роксидного числа в липидах, окисление которых ускорено нагреванием до 40-50 °С или иными способами. Пероксидное число - это удельное содержание LOOL, LOOH и LOO в масле (LH), выраженное в мг-экв пероксидного кислорода (О) в пересчете на 1 кг масла. Измерение обычно осуществляется в реакции окисления йода липидными перекисями:

По окончании реакции молекулярный йод титруется стандартным тиосульфатным раствором с использованием крахмала в качестве индикатора завершения процесса титрования:

Когда в среде не остается молекулярного йода, то исчезает синяя окраска, обусловленная комплексированием молекулярного йода крахмалом. Растворимый крахмал добавляют в самом конце титрования. Иначе он, связывая I, с образованием комплекса синего цвета, затрудняет взаимодействие I, с тиосульфатом.

Пероксидное число - не очень надежный показатель, так как пероксиды нестабильны и интенсивное окисление липидов может происходить без их накопления. Кроме того, молекулярный йод может включаться в липиды, насыщая двойные связи жирных кислот. Поэтому с помощью молекулярного йода можно также тестировать степень ненасыщенности жирных кислот.

Широко применяется тест, основанный на определении диеновых конъюгатов (-С=С-С=С-) В 1931 г. Альберт Джиллам и соавторы показали, что у природных жиров при хранении постепенно возрастает поглощение ультрафиолета при 230- 235 нм, а в 1933 г. было доказано, что этот пик поглощения обусловлен диеновыми конъюгированными связями. Метод был разработан в 1960-х годах. Обычно этим

Рис. 34.

методом определяют окисление РСТА,

ускоряя его тем или иным способом, например нагреванием. Однако в живых организмах очень много веществ, поглощающих УФ с длиной волны 230- 235 нм. Поэтому этот метод можно применять только к липидным экстрактам, очищенным от хлорофилла, нуклеиновых кислот, белков. Тестируемый антиоксидантный экстракт, конечно же, не должен содержать веществ, поглощающих свет в этой области спектра.

TBARS-тест (thiobarbituric acid reactive substances) состоит в выявлении соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТВА). Среди продуктов пероксидации липидов только малоновый диальдегид реагирует с ТВА с образованием флуоресцентного соединения розового цвета, имеющего пик поглощения при 532-535 нм (рис. 34). Для тестирования обычно используется водная эмульсия линоленовой кислоты с детергентом (додецилсульфат натрия или TWEEN). Для улучшения перемешивания с водорастворимым антиоксидантом в смесь также добавляют этанол. Далее производится форсированное окисление субстрата (± антиоксидант), по окончании которого определяются TBARS. Для построения калибровочной кривой используется 1,1,3,3-тетраметоксипропан. Метод TBARS позволяет лишь приблизительно оценить уровень пероксидации липидов, так как доля малонового диальдегида среди конечных продуктов пероксидации липидов может быть различной.

Ряд методов базируется на определении других конечных продуктов окисления липидов, например 2-гексеналя (см. рис. 16). Гексеналь - один из основных конечных продуктов пероксидации липидов, определяющий запах прогорклого масла. Этот запах появляется, когда содержание гексеналя достигает 1 мг на 100 г масла. Кроме того, часто измеряют этан и пентан, например, в выдыхаемом человеком или животным воздухе. Эти вещества идентифицируют с помощью газовой хроматографии.