МЗРФ

ДВГМУ

Кафедра общей, физической и коллоидной химии

Реферат

Тонкослойная хроматография. Применение в фармации

Выполнил: студент группы 201-Ф

Данилов Д. И.

Проверил: Немов В. А.

г. Хабаровск, 200 5

ПЛАН:

Введение

Физико-химические основы ТСХ

Распределительная хроматография на бумаге

Основы тонкослойной хроматографии

• сорбенты
• растворители
• подготовка пластин
• техника нанесения исследуемых растворов

Хроматографирование

Сушка пластин.

Идентификация разделенных веществ

Применение метода ТСХ в фармации

• Количественное определение тритерпеновых сапонинов методом ВЭТСХ с использованием сканирующей денситометрии
• Изучение липидного и флавоноидного состава образцов некоторых видов рода Чина (Lathyrus.)

Заключение

Литература

Введение

Тонкослойная хроматография (ТСХ, TLC) - один из наиболее используемых методов хроматографического анализа, но наименее популяризируемый.
Несмотря на существовавшие до недавнего времени существенные недостатки, она широко используется для качественного анализа смесей, в основном, за счет дешевизны и скорости получения результатов. Тонкослойная хроматография (ТСХ) первоначально была разработана для разделения липидов. Хотя хроматография на бумаге быстрее, чем хроматография на колонке, к недостаткам ее следует отнести то, что бумага может быть изготовлена только из материалов на основе целлюлозы, что не позволяет применять ее для разделения неполярных веществ. Тонкослойная хроматография сохраняет все преимущества хроматографии на бумаге, но при этом позволяет использовать любой материал, который можно тонко измельчить и получить затем однородный слой. Это могут быть неорганические вещества, например силикагель, окись алюминия, диатомовая земля и силикат магния, а также органические вещества, в частности целлюлоза, полиамиды и порошок полиэтилена.

Физико-химические основы тонкослойной хроматографии.

Основой тонкослойной хроматографии является адсорбционный метод, хотя также встречается метод распределительной хроматографии.
Адсорбционный метод основан на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-вальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).
Для эффективных процессов сорбции-десорбции необходима большая площадь, что предъявляет определенные требования к адсорбенту. При большой поверхности разделения фаз происходит быстрое установление равновесия между фазами компонентов смеси и эффективное разделение.
Еще одним видом используемом в методе тонкослойной хроматографии является распределительная жидкостная хроматография.
В распределительной хроматографии обе фазы - подвижная и неподвижная - жидкости, не смешивающиеся друг с другом. Разделение веществ основано на различии в их коэффициентах распределения между этими фазами.
Впервые метод тонкослойной хроматографии заявил о себе как "Бумажная тонкослойная хроматография", которая основывалась на распределительном методе разделения компонентов.

Распределительная хроматография на бумаге.

В связи с тем, что используемая в этом методе хроматографическая бумага (специальные сорта фильтровальной бумаги) содержат в порах воду (20-22%), в качестве другой фазы используются органические растворители.
Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода.
Поэтому можно считать закономерным появление хроматографии в тонком слое сорбента - тонкослойной хроматографии.

Основы тонкослойной хроматографии.

В методе ТСХ хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции.
Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод.
В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. Но на сегодняшний день в основном используются пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам.
Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например политерефталат). В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры.
Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

Сорбенты

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель.
Силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм).
Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служит группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.
Окись алюминия. Окись алюминия является слабо основным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100-150 0 С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.
Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем.
Кремнекислый магний менее полярный чем силикагель и обычно используется в случаях, когда более полярные адсорбенты не дали эффективного разделения.
Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Но как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.
В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента используют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или активные сульфогруппы, участвующие в ионном обмене. Тонкослойная хроматография с такого типа пластинками, проводится с подвижными фазами содержащими сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений.

Вышеперечисленные сорбенты являются наиболее распространенными, но помимо этих существуют множество веществ, используемых как сорбенты. Это тальк, сульфат кальция, крахмал и т.д..
В то же время даже уже указанные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств (пропитка сорбентов реактивами, например AgNO 3 , создание пластин с обращенной фазой). Именно такое разнообразие возможных фаз при минимальных затратах позволяют использовать ТСХ для хроматографирования огромного числа веществ.

Растворители

В тонкослойной хроматографии, в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо смеси веществ (системы) в определенном соотношении.
Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам:

· Выбирают такую систему, в которой разделяемые компоненты имеют небольшую растворимость (если растворимость вещества высокая, то вещества будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте). При распределительной хроматографии или при использовании обращенных фаз, растворимость веществ должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной.

· Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.

· Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.

· Система должна полностью разделять вещества близкого строения, причем различия в Rf должно быть не менее 0,05.

· Система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов.

· В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения Rf и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения Rf лежало в пределах 0,05-0,85.

· При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ. Так, при хроматографировании веществ, имеющих основные свойства система не должна обладать кислотными свойствами и наоборот.

Подготовка пластин

При использовании приобретенных пластин, для хроматографирования их необходимо предварительно подготовить. Это связано с тем, что адсорбенты пластин при хранении сорбируют не только влагу, но и другие вещества, содержащиеся в воздухе. При использовании неподготовленных пластин в процессе хроматографирования появляется фронт "грязи", который может мешать определению веществ, имеющие большие значения Rf, а некоторые вещества, например вода, может изменять состав подвижной фазы, изменяя тем самым получаемые значения Rf.
Предварительная подготовка пластин заключается в разгонке пластин чистым растворителем на всю высоту пластинки (метанол, бензол, диэтиловый эфир),с последующей сушкой пластины в сушильном шкафу при температуре 110-120 0С в течении 0,5-1 часа. Таким способом можно подготовить сразу несколько пластин и при хранении их в сухом герметичном месте, сохраняют свои свойства несколько месяцев.

Техника нанесения исследуемых растворов.

Как оказывается, нанесение исследуемого вещества не такая сложная операция, но вместе с тем, она очень влияет на получаемые результаты хроматографирования.
Часто, исследованию подвергаются либо жидкие анализируемые вещества, либо растворы твердых веществ, без какой либо предварительной пробаподготовки.
Поэтому необходимо всегда помнить ряд моментов, серьезно влияющие на результаты разделения.
Наиболее важным является концентрация наносимых веществ. В ТСХ принято наносить концентрации растворов около 1%. Но с другой стороны чувствительность метода позволяет определять вещества с гораздо меньшими концентрациями.
Если в исследуемом веществе неизвестна общая концентрация компонентов, или известна концентрация но такого типа вещества еще не хроматографировали, нужно определить какое количество исследуемого раствора достаточно для качественного хромаграфирования. Существуют несколько приемов, позволяющие это определить.
Для начала нужно нанести несколько пятен хроматографируемых растворов, равные по размеру, но с различным количеством (например 1, 2, 5 мкл) и после хроматографирования изучить форму и размеры разделенных пятен.
Так при правильно подобранной концентрации форма разделенных веществ такая же, как и форма нанесенной на линии старта. Если разделенные пятна имеют большие размеры, чем пятно на старте, то нанесенная концентрация слишком велика. Появление "хвостов", неправильная форма разделенных пятен на пластинке тоже может говорить о высокой концентрации, но может быть вызвана неправильно подобранной хроматографической системой, либо химическим взаимодействием разделяемых компонентов.
Подбором количества нанесенного вещества и системы растворителей можно добиться полного разделения на одной пластинке до десяти компонентов в исследуемых веществах. Удобно наносить образцы на специальном столике с трафаретами и подогревом. Нанесение пятен проводят на "линии старта" 1-2 см от нижнего края пластинки. Это необходимо для того, чтобы при опускании пластинки в систему не происходило растворение в ней образцов, а все нанесенное вещество подверглось хроматографированию.
Нанесение растворов проводят либо микрошприцом, либо отградуированными капиллярами. Размер наносимого пятна не должен превышать 4 мм. Это связано с тем, что при большем размере пятна, происходит изменение формы под действием физических сил, да и границы разделенных компонентов могут перекрываться.
Нанесение на пластины исследуемых веществ не должны сопровождаться разрушением сорбента (что довольно сильно влияет на качество разделения), поэтому капля должна наноситься касанием иглы или капилляра о слой сорбента, а не надавливанием. На размер образующегося пятна влияет не только количества наносимого раствора, но и от полярности растворителя и его температуры кипения. Так при нанесении одного и того же вещества в различных растворителях, образовавшееся пятно в котором в качестве растворителя использовался метанол будет больше, чем пятно от раствора хлороформа. с другой стороны при подогреве подложки испарение растворителей будет интенсивнее и размер пятна также уменьшается.
Конечно, проще использовать при нанесении для подсушивания пятен фен, но только в том случае, когда есть полная уверенность, что наносимые вещества не будут окисляться под действием горячего воздуха.
Расстояние между наносимыми пятнами должно быть около 2 см.
Иногда при хроматографировании на пластинках наблюдается краевой эффект, в результате чего пятна располагаются не на одной линии а имеют вид подковы, либо по диагонали. Для устранения этого эффекта каждое пятно можно "снабдить" своей дорожкой, отделив нанесенный образец от других путем удаления линии сорбента. Это лучше всего делать под линейку острым предметом (типа скальпеля) но осторожно, чтобы не удалить слишком много сорбента.
После нанесения исследуемых веществ на пластинку, необходимо добиться полного удаления растворителей, так как даже небольшое содержание растворителя в исследуемом веществе может повлиять на разделение и даже изменить состав хроматографической системы.
Удаление растворителей обычно проводят естественной сушкой пластин 5-10 мин, либо при нагревании феном или в сушильном шкафу.

Хроматографирование

Тонкослойная хроматография имеет несколько способов, связанных, в основном, с видом движения растворителей.

· Восходящая тонкослойная хроматография

· Нисходящая тонкослойная хроматография

· Горизонтальная тонкослойная хроматография

· Радиальная тонкослойная хроматография.

Восходящая тонкослойная хроматография

Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, т.е. фронт хроматографической системы движется снизу-вверх. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.
Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется. Для устранения этого недостатка по стенкам хроматографической камеры прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, по которым поднимающаяся хроматографическая система насыщает парами камеру по всему объему.
Некоторые хроматографические камеры имеют на дне разделение на две ванночки. Это усовершенствование позволяет не только уменьшить расход хроматографической системы (для получения необходимой высоты хроматогратографической системы требуется меньший объем) но и использовать дополнительную кювету для растворителя, увеличивающего давления насыщенных паров в камере.
Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" лини фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить действительное значение Rf уже не представляется возможным.

Нисходящая тонкослойная хроматография

Этот метод хроматографии основан на том, что фронт хроматографической системы опускается по пластинке в основном под действием сил тяжести, т.е. фронт подвижной фазы движется сверху вниз.
Для этого метода в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель, который стекает и происходит хроматографирование исследуемого образца.
К недостаткам этого метода можно отнести усложнение оборудования. Этот метод используется в основном в бумажной хроматографии.

Горизонтальная тонкослойная хроматография

Этот метод наиболее сложен в аппаратурном оформлении но наиболее удобен. Так, в хроматографической камере пластинка размещается горизонтально и подача системы происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт растворителя движется в противоположную сторону.
Есть еще один прием, позволяющий предельно упростить камеру. Для этого хроматографическую пластинку на алюминиевой основе слегка изгибают и помещают в камеру. В данном случае система будет поступать с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как пластиковая и стеклянная основа "несгибаема", т.е. не сохраняет форму.
К достоинствам этого метода можно отнести то, что в горизонтальной кювете насыщение парами системы происходит гораздо быстрее, скорость движения фронта постоянная. А при хроматографировании с двух сторон, фронт не "убегает"

Радиальная тонкослойная хроматография.

Радиальная тонкослойная хроматография заключается в том, что в центр пластинки наносится исследуемое вещество и туда же подается система, которая движется от центра к краю пластинки.

Сушка пластин.

После процесса разделения исследуемых веществ, пластинки сушат. Это тоже немаловажный процесс, так как при наличии на пластинке даже следов растворителя, возможно получить неправильные результаты хроматографирования.
Если хроматографическая система имела в своем составе только легкокипящие компоненты, то достаточно естественной сушки в течении 3-5 минут. Если же в состав системы входят высококипящие жидкости (спирты, вода, органические кислоты и т.д.), сушку пластин нужно проводить не менее 10 мин или помещать пластинку в сушильный шкаф.

Идентификация разделенных веществ.

Высушенная пластинка является хроматограммой исследуемых веществ. Если вещества являются окрашенными, то идентификация начинается с определения цвета разделенных веществ.
Но в большинстве случаев разделяемые вещества бесцветны и простое визуальное сравнение невозможно.
Для тонкослойной хроматографии существует несколько видов качественного анализа (идентификации) разделенных веществ:

· Визуальные методы и определение Rf разделенных веществ.

· Цветные реакции.

· Сравнение со свидетелями.

· Физико-химические методы идентификации.

Рассмотрим подробнее каждый вид качественного анализа в тонкослойной хроматографии.

Физические методы

Визуальные методы используются в основном, для определения местоположения пятен разделенных веществ на хроматографической пластинке. Для этого пластинку рассматривают как в видимом свете, так и используя ультрафиолетовый свет (в основном свет с длиной волны 366 и 254 нм)
Это первый этап идентификации, на котором определяется качество подобранных условий и полученных результатов хроматографирования.
Так, определив качество хроматографирования (отсутствие "хвостов" разделяемых веществ или перекрытие их пятен, правильную форму и размеры, отсутствие слияния хроматографических дорожек и т.д.) и признании пригодным проведенного разделения для дальнейшего исследования, определяют Rf выявленных пятен.

Значение Rf.

Одним из основных показателей в ТСХ является показатель Rf. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров.
Определение значения Rf проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя

Значение Rf - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1. Однако в литературе нередко встречается такие показатели как hRf, Rf×100, которые являются тем же Rf, но умноженными на 100, для того, чтобы не оперировать десятичными значениями.
На значение Rf не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя, однако во многих методиках описывается прохождение фронта на расстояние 10 см. Это используется только для облечения расчетов Rf.
На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования. Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества. Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное Rf имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении Rf такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1!
В случае распределительной хроматографии коэффициент распределения вещества и его Rf связано соотношением:

где Sп и Sн -площади поперечных сечений подвижной и неподвижной фазы.
Как мы видим, Коэффициент распределения, при постоянном отношении Sп/Sн есть величина пропорционально зависящая от Rf , и может быть определена через него.

Цветные реакции.

Цветные реакции в тонкослойной хроматографии используются чрезвычайно широко. Они служат не только для определения местоположения разделенных компонентов (обработка серной кислотой, парами йода), но и определения как класса веществ, так и идентификации (при наличии индивидуальных реакций).
Мы не будем здесь рассматривать это огромное разнообразие цветных качественных реакций, скажем лишь, что при совпадении всех качественных реакций и совпадении полученных значений Rf вещества в трех различных системах с литературными данными, вещество идентифицировано. Хотя, на мой взгляд, необходимо дополнительное подтверждение исследованием другим физико-химическим методом.

Сравнение со свидетелем.

При проведении исследований веществ с предполагаемым составом, применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом. Этот метод используется кода трудно выдержать условия хроматографирования, нет литературных данных Rf для данной системы или адсорбента, использование градиентного метода и т.д. Да и при проведении цветных реакций можно сравнить не только цвета, но и оттенки исследуемых веществ и свидетелей, что также немаловажно.
С другой стороны этот метод требует дополнительных расходов на свидетели.

Методы количественного анализа

Количественный анализ в тонкослойной хроматографии имеет несколько видов, характеризующий каждый этап развития метода. И хотя некоторые методы можно применять только как полуколичественные, они до сих пор применяются на практике.

Метод визуального сравнения. Как говорилось выше, интенсивность окраски пятна и его размер от количества хроматографируемого вещества. Поэтому визуальное количественное определение построено на нескольких приемах.
Метод разбавления . Этот метод заключается в том, что для каждого вещества определяют предельную концентрацию, при которой вещество не может быть определено хроматографическим методом. При хроматографировании исследуемого вещества поводят разбавление до тех пор, пока оно перестает проявляться на пластинке.
Содержание вещества С, определенное таким методом находят по формуле:

где n -разбавление, а -концентрация вещества, при котором оно не проявляется при хроматографировании.
Метод определения площади пятна. Если наносить одинаковые объемы исследуемых веществ и свидетелей, то получившиеся после хроматографирования площади пятен пропорциональна логарифму концентрации вещества. S= aln c + b

где а и b - эмпирические коэффициенты, определяемые экспериментальным путем.
Если пятно разделенного вещества имеет резкие границы, то площадь пятна можно определить весовым методом (вырезать пятно и взвесить), замеряется планиметром. Этот метод дает ошибку до 10-15%.
Однако он имеет ряд существенных недостатков. Первый и самый существенный в том, что таким образом можно определять концентрацию окрашенных веществ или имеющих флуоресценцию в УФ области (254, 366 нм). Этот недостаток можно устранить добавлением в сорбент различных люминофоров, то при этом увеличивается погрешность определения.
Обработка пластин проявляющими веществами (реактивами) также может быть использована (например использование фильтровальной бумаги пропитанной проявляющим реагентом с последующим контактом с хроматографической пластинкой и дальнейшим определением на ней площади проявленного вещества), но погрешность определения также высока.
Необходимость более достоверного результата количественного определения привела к использованию инструментальных методов.
Метод элюирования . Этот метод заключается в том, что разделенное вещество смывают с сорбента растворителем и определяют его концентрацию уже другими методами - фотометрическими, полярографическими и т.д. Это достаточно точный метод, но только при условии количественного выделения разделенного вещества. Из-за высокой трудоемкости метод используется достаточно редко и неприемлем при большом количестве исследуемых образцов.
Фотографический метод определения заключается в фотографировании пластинок с разделенным веществом и дальнейшим определением степени почернения, с использованием десинтометров.
Радиографический метод аналогичен фотометрическому, только с той разницей, что определяется почернение пластинки, вызванное излучением разделенного вещества. Этот метод используется только при определении веществ с меченными атомами.
Фотодесинтометрический метод может быть использован без выделения вещества с пластинки и основан на определении не только площади пятна, но и его интенсивности.
Это наиболее точный метод определения концентрации веществ, так как позволяет при использовании калибровочных графиков, проводить достаточно точные количественные определения всех разделенных веществ (до 2-10%) непосредственно на пластинке за короткий промежуток времени.
Неудивительно, что при развитии тонкослойной хроматографии, применение десинтометров увеличивается, чувствительность и, следовательно, точность определения концентрации разделенных веществ повышается и приближается к точности высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Рис. 1. Типичная камера для проявления хроматографической пластинки с тонким слоем

1. крышка
2. стеклянная камера
3. пластинка ТСХ
4. сорбент
5. место нанесения пробы
6. растворитель

Типичная ТСХ хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот.

На хроматограмме FAME = fatty acids methyl esters = метиловые эфиры жирных кислот. Start = точка нанесения разделяемых смесей.

Хроматограмма выполнена на пластинке Sorbfil. Система - бензол. Проявление - обугливание после опрыскивания серной кислотой.

Точка 1 - метиловые эфиры жирных кислот. Точка 2 - продукты метилирования общих липидов.

Стрелкой показано направление движения фронта растворителя (системы). Фронт растворителя при хроматографировании двигался до верхнего края пластинки.

Применение метода ТСХ в фармации

Большое значение хроматографических методов для фармации связано с тем, что при производстве лекарств во многих случаях требуется предварительное выделение природных или синтетических продуктов в чистом виде. Проведение анализов также часто основано на разделении смесей на компоненты. Рассмотрим два примера применения метода ТСХ, доказывающих его значимость в анализе и производстве лекарственных веществ.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ МЕТОДОМ ВЭТСХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СКАНИРУЮЩЕЙ ДЕНСИТОМЕТРИИ

Тритерпеновые сапонины (гликозиды) являются действующимн веществами многих лекарственных препаратов.

Большая часть применяемых в настоящее время ме­тодик количественного определения тритерпеновых сапонинов основана на кислотном гидролизе послед­них с дальнейшим определением агликона чаще всего титрометрическими, реже - спектральными метода­ми анализа.

Подобные методики, основанные на разрушении молекул сапонинов, имеют ряд недостатков. Они дли­тельны, не позволяют количественно оценить соотно­шение индивидуальных сапонинов в суммарных сапонинсодержащих препаратах.

В большинстве случаев авторы ограничиваются, как правило, качественной оценкой, используя метод ТСХ, наиболее доступный и простой хроматографическнй метод анализа. Применение ТСХ для определения количественного содержания компонен­тов сдерживается отсутствием сканирующих денсито­метров.

В настоящей работе приведены результаты количе­ственного ТСХ-определения некоторых тритерпено­вых сапонинов, производных олеаноловой кислоты, в фармпрепаратах и извлечениях из растительного сырья.

В качестве объектов исследования нами были вы­браны тритерпеновые сапонины аралии маньчжурской (аралозиды). качественное определение которых в раз­личных объектах освещено в работах, а также тритерпеновые сапонины сахарной свеклы - вещест­ва с предварительно установленной фармакологиче­ской активностью. И те, и другие являются производными олеаноловой кислоты с небольшим (не более четырех) количеством сахарных остатков, что предполагает их сходное поведение в тонком слое сор­бента

В качестве стандартов использовали сумму аралозидов, выделенных из таблеток "Сапарал" и сумму сапонинов сахарной свеклы, выделен­ных из свежеубранных корневищ. Для нанесения на пластину готовили водно-спиртовые (80 % по этанолу) растворы сапонинов с содержанием последних 0,4 - 2,0 мг/мл. Хроматографирование про­водили с использованием пластин для ТСХ "Силуфол" (Чехия) 15 х 15 см, "Армсорб" для ВЭТСХ (Армения) 6 х 10 см и "Сорбфил" (Россия) 10 х 10см. Высота подъема фронта, достаточная для полного разделения, составляла 10,6 и 6 см, соответственно. Пробы наносили при помощи мнкрошприца МШ-10 (Россия) на пластину, подогретую до 40 "С. Оптимальный объем наносимой пробы - 3-5 мкл. Нанесение проводили в несколько приемов так, чтобы диаметр стартового пятна не превышал 2 мм.

Хроматографирование осуществляли при темпера­туре 20 - 25 °С. По окончании элюирования пластины подсушивали на воздухе и обрабатывали детектирую­щим реагентом при помощи лабораторного стеклянно­го пульверизатора. Сканирование зон проводили с ис­пользованием сканирующего денситометра “ Shimadzu CS-9000" (Япония). Сравнивали качество зон, получа­емое при хроматографировании в трех, наиболее часто рекомендуемых элюирующих системах: I. хло­роформ - метанол - вода (30:17:3): II. н-бутанол - этанол - аммиак (7:2:5); III. н-бутанол - вода - ук­сусная кислота (4:5:1), верхний слой; IV. бензол - этилацетат (1:1) (для сапонинов сахарной свеклы).

В качестве детектирующих реактивов использовали 25 % спиртовый раствор фосфорновольфрамовой кис­лоты (малиновые пятна сапонинов на белом фоне). наиболее часто применяемый для количественных ТСХ-определений подобных соединений и 10 % спир­товый раствор фосфорномолибденовой кислоты, реко­мендуемый для проявления зон тритерпеноидов (зоны сапонинов темно-синие на желтом фоне). Обра­ботка пластин парами аммиака в последнем случае по­зволяет обесцветить фон и повысить контрастность пятен.

В результате проведенных исследований были вы­браны оптимальные для денситометрического опреде­ления условия проведения хроматографического про­цесса. Лучшими из трех типов пластин были призна­ны "Армсорб" для ВЭТСХ. Высокой эффективности процесса способствует тонкий (II0 мкм) и однород­ный по фракционному составу (5-10 мкм) слой силикагеля, обеспечивающий хорошее разделение и минимальное размывание зон уже при подъеме фронта рас­творителя на 6 см. Почти не уступают им по разделительной способности пластины "Сорбфил", но время элюирования на них почти вдвое больше. Пластины "Силуфол" при достаточно высокой скорости элюирования позволяют разделить компоненты при большем хроматографичесюм пути, что приводит к некоторому размыванию зон, однако их использование также возможно.

Элюирование может быть проведено достаточно ка­чественно в любой из первых трех элюирующих сис­тем. I дает выигрыш во времени, IV позволяет получить лучшее разделение сапонинов сахарной свеклы, чем первые три.

Оба детектирующих реагента дают достаточно ста­бильное окрашивание зон при проведении сканирова­ния в течение 1 - 2 ч с момента проявления. По исте­чении этого срока зоны сапонинов на пластинах, обра­ботанных фосфорнонольфрамовой кислотой, изменяют окраску от малиновой до фиолетовой, что может привести к искажению результатов количест­венного анализа при сканировании. Обработка фосфорномолибденовой кислотой в этом случае более предпочтительна. При хранении в защищенном от све­та месте пластины с зонами, проявленными этим реак­тивом, дали вполне воспроизводимые результаты по истечении нескольких месяцев с момента проявления.

Предел обнаружения сапонинов составил 5 мкг в пробе при проявлении фосфорновольфрамовой кисло­той и 0,5 мкг в пробе при проявлении фосфорномо-либденовой кислотой. Обработка парами аммиака по­зволила снизить предел обнаружения сапонинов в по­следнем случае до 0,2 мкг в пробе.

Количественное определение сапонинов методом ТСХ с использованием сканирующей денситометрии проводили на пластинах "Армсорб" (скорость хроматографирования в этом случае в 2 раза выше) или "Сорбфил", во II и III элюирующей системе (как со­держащих менее токсичные компоненты). Детектиро­вание зон осуществляли 10 % раствором фосфорномолибденовой кислоты. Объем наносимой пробы не бо­лее 5 мкл, высота подъема фронта элюента - 6 см, время элюирования 30 - 60 мин. Длина волны при ска­нировании λ = 675 нм. После обработки пластин сапо­нины аралии и сахарной свеклы проявляются в виде трех зон разной интенсивности.

Общий вид денситограмм, полученных при скани­ровании, представлен на рис. 1.

Сравнение хроматограмм сапонинов, выделенных из таблеток "Сапарал" (рис. 1, а) и "Настойки аралии" (рис. 1,6) позволяет отметить различное соотношение 44

аралозидов А, В и С, входящих в состав этих лекарст­венных форм. Подобное непостоянство соотношения индивидуальных сапонинов в сырье в зависимости oт условий произрастания растения отмечалось и ранее. Соотношение сапонинов в готовых лекарственных формах легко оценить при помощи полученных денси­тограмм. Поскольку на хроматограмме обнаруживает­ся 3 зоны, соответствующие сапонинам, а на денситограмме, соответственно, три пика, при построении градуировочной зависимости площади всех пиков суммировали. Ошибка в этом случае была ниже, чем при проведении расчетов по параметрам пика одного из компонентов, учитывая непостоянство их соотношения (рис. 2).

Рис. I. Денситограммы, полученные при сканировании ТСХ-пластин: а - сапонины аралии, выделенные из таблеток “Сапарал”; 6 - сапонины настойки аралии; в - сапонины сахарной свеклы. Суммарное содержание сапонинов в пробе - 5 мкг. А, В, С - пики сапонинов; 0 - линия старта; f - линия фронта.

Рис. 2. Градуировочная зависимость суммы площадей пикон сапонинов на хроматограмме от их содержания в пробе. / - са­понины аралии; 2 - сапонины сахарной свеклы. По оси абцисс - солержание сапонинов в пробе (мкг), по оси ординат -сум­ма площадей пиков (см 2).

Градуировочную зависимость суммы площадей пи­ков на денситограмме от содержания вещества в пробе получали хроматографированием серии стандартных растворов с известным содержанием сапонинов. Ис­ходный раствор готовили растворением в 80 % этано­ле точной навески сапонинов, высушенной до посто­янной массы. Серию рабочих растворов готовили по­следовательным разбавлением исходного 80% этанолом. Содержание сапонинов в них составляло 0,04 - 2,0 мг/мл (0,2 - 10 мкг в пробе при объеме про­бы 5 мкл). Этот концентрационный диапазон можно считать оптимальным при сканировании. Минималь­ное содержание сапонинов, определяемое этим мето­дом, составляет 0,2 мкг/пробе. Относительное стан­дартное отклонение в этом случае не превышает 0,03.

Полученные градуировочные зависимости имеют нелинейный характер, что полностью согласуется с те­орией Кубелки - Мунка, учитывающей поглощение и рассеивание света сорбентом. В узком диапазоне малых концентраций зависимости можно рассматри­вать как линейные (0,2 - 2,0 мкг/пробе). Нелинейная часть кривых может быть линеаризована переводом количества вещества в пробе и площади пика в обратные величины и приобретает вид, представлен­ный на рис. 3.

Рис. 3. Зависимость обратной величины суммы площадей пи­ков сапонинов на хроматограмме (1/S 10 -1) от их обратной величины содержания в пробе (1/m - 10 -1). 1 -сапонины ара­лии; 2 - сапонины сахарной свеклы.

При помощи полученной градуировочной зависи­мости определяли содержание сапонинов в настойке аралии. 5мл настойки разбавляли 70% этанолом в мерной колбе емкостью 25 мл. 5 мкл полученного рас­твора наносили на стартовую линию пластаны ""Арм­сорб". В соседнюю точку наносили 5 мкл стандартно­го раствора аралозидов с концентрацией I мг/мл (5 мкг в пробе). Пластинки обрабатывали, как описано выше.

Отличие полученных результатов от результатов определения по ФС 42-1647-93 (5,3 мг/мл) состави­ло 6 - 7 % в сторону завышения, что может быть объ­яснено потерями сапонинов при проведении много­стадийной предподготовки пробы по ФС (таблица).

Описанным выше способом были проведены опре­деления сапонинов в таблетках "Сапарал" и в растите­льном сырье (корнях аралии маньчжурской и корневи­щах сахарной свеклы) с предварительной исчерпыва­ющей экстракцией сапонинов из таблеток из сырья - 80 % горячим этанолом. Отклонения от резу­льтатов определения по ФС 42-1755 - 81 для таблеток (0,040 г) находятся в тех же пределах, что и для на­стойки (таблица).

Таким образом показана возможность экспрессного количественного определения некоторых тритерпеновых сапонинов, производных олеаноловой кислоты в фармпрепаратах и растительном сырье методом ВЭТСХ с последующей количественной оценкой полученных зон с использованием сканирующей денси­тометрии.

Результаты определения достаточно хорошо корре­лируют с результатами определения по ФС. Методика позволяет сочетать определение подлинности препа­ратов методом ТСХ (по ФС) с последующим сканиро­ванием зон компонентов на пластинах и их количест­венной оценкой. Хроматограммы, полученные при сканировании, позволяют определить также соотно­шение индивидуальных сапонинов в анализируемых объектах.

Результаты количеетвевного определения аралозндов в на- CTofik- c аралии (I) и таблетках "Сапарал" (2) методом ТГХ с использованием сканирующей дснсптоиетрнн /" = 0,95, и - 5, /=2,78,/=4

ИЗУЧЕНИЕ ЛИПИДНОГО И ФЛАВОНОИДНОГО СОСТАВА ОБРАЗЦОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА ЧИНА ( Lathyrus .)

Из многих представителей семейства Бобовые, та­кие как люцерна, люпин клевер, вика были выделены флавоноиды, обладающие широким спектром дейст­вия: противовоспалительным, ранозаживляющим, со-судоукрепляющим и т.д. Из красного клевера были выделены изофлавоны: биоханин А - 0,8 % и формо-нонетин - 0,78 %, обладающие эстрогенной активно­стью.

Нами изучался флавоноидный состав в отдельных видах рода чина: ч.посевная (I), члуговая (II), ч.весен­няя (III), ч.лесная (IV).

С целью возможного использования липидного комплекса в пищевых добавках и лекарственных пре­паратах нами также изучался полный фракционный состав липидов в траве и семенах чины.

Материалы и методы

Выделение липидной фракции из сухого сырья про­водили по методу Блая и Дайера.

К навеске (0,2 г) сухого растительного сырья добав­ляли 1,6 мл дистиллированной воды и выдерживали в течение суток на холоду. Затем добавляли 6 мл смеси хлороформ - метанол (1:2) и оставляли на 3 суток, после чего центрифугировали при 8 тыс. об/мин - 15 мин. К прозрачному супернатанту добавляли 2 мл воды и 2 мл хлороформа. Образовавшуюся 2-х фазную систему разделяли в делительной воронке. Хлорофор­мный слой дважды промывался метанолом и упари­вался досуха на роторном испарителе. Остаток суши­ли в вакуум-эксикаторе, затем разбавляли хлорофор­мом до концентрации 10 мг/мл и раствор хранили в стабилизированном хлороформе при + 4°С.

Качественный анализ липидной фракции проводи­ли с использованием метода ТСХ на пластинах Кизельгель 60 (254) в следующих системах растворителей:

А. Для нейтральных липидов: 1) Гексан - бензол (9:1) ; 2) Гексан - эфир - уксусная кислота (90:10:1) .

Б. Для полярных липидов (фосфолипидов): 1) хло­роформ - ацетон - метанол - уксусная кислота - вода (6:8:2:2:1), кислый; 2) хлороформ - мета-

нол - 26% аммиак (65:25:5), основной; 3) хлороформ - метанол - вода (65:25:4), нейтра­льный.

При определении качественного состава фосфоли­пидов их идентификация проводилась с использовани­ем различных проявителей (пары йода, нингидрин, ре­актив Драгендорфа, серная кислота) и с помощью R f стандартов.

Вышеперечисленный набор систем и реактивов по­зволил исчерпывающе провести анализ липидных фракций, выделенных из образцов чины.

Для изучения флавоноидного состава с учетом фаз вегетации были выбраны следующие образцы: I (фаза цветения); IV (фаза цветения); III (сочевичник) фаза бутонизации; II (фаза цветения); II (фаза плодоноше­ния); II (фаза вегетации до цветения).

Выделение флавоноидов из сухого сырья проводи­лось по методике, обеспечивающей их исчерпывающую экстракцию.

С этой целью, 1 г измельченной травы помещали в колбу с обратным холодильником, заливали 20 мл 70 % этанолом и кипятили в течение 20 мин на водя­ной бане. Экстракт охлаждали, фильтровали через стеклянный фильтр Шотта и упаривали досуха на ро­торном испарителе. Остаток растворяли в спирте эти­ловом до конечной концентрации вещества 10 мг/мл. Определение суммарного содержания флавоноидов проводилось с использованием рутина в качестве стандарта. Результаты этого исследования приведены в табл. 3.

Определение качественного состава флавоноидов проводилось методом ТСХ на пластинках Кизельгель 60(254) фирмы Мерк, в системе растворителей н-бутанол - уксусная кислота - вода (6:1:2). Обнаружи­тель - серная кислота при УФ (254 нм) - пятна фла­воноидов сиреневого цвета на зеленом фоне.

Таблица 1

Суммарное содержание флавоноидов в сырье (трава) различ­ных видов чины (в %, в пересчете на абсолютно сухую массу)

Рис. 1. ТСХ флавоноидного состава отдельных видов рода Чина. С - сумма свидетелей флавоноидов: ононин - R f 0,28; рутин - R ,0,48; лютеолин-глюкозид - R f 0,58; формононетин - R f 0,64; кверцетин - R f 0,79: лютеолин - R f 0,82; биоханин А - R f 0,85; апигенин - R f 0,92.

Рис. 2. ТСХ флавоноидов чины луговой по разным фазам веге­тации. IIа - фаза цветения; IIб - фаза плодоношения: IIв - фаза вегетации до цветения. С - сумма свидетелей флавонои­дов: ононин - R f f 0,28; рутин - R f 0,48; лютеолин-глюкозид - R f 0,58; формононетин - R f 0,64; кверцетин - R f 0,79; лютео­лин - R ( 0,82; биоханин А - R f 0,85; апигенин - R f 0,92.

При исследовании флавоноидного состава II в раз­ных фазах вегетации отмечено, что кроме рутина и кверцетина, в экстракте присутствуют в заметном ко­личестве ононин и формононетин. Остальные флавоноиды найдены в следовых количествах.

Таким образом показано, что в различных видах чины, в различные фазы вегетации содержатся как гликозиды, так и агликоны - ононин, рутин, лютео­лин-глюкозид и их агликоны: формононетин, кверце­тин и лютеолин, причем состав их меняется как в за­висимости от вида растения, так и у одного растения (чина луговая) в зависимости от фазы вегетации.

Таблица 2

Количественное содержание основных флавоноидов в отдель­ных представителях рода чины (в %, в пересчете на абсолют­но сухую массу)

У II в вегетативном периоде найден как ононин, так и формононетин. В период цветения и плодоношения количество ононина заметно снижается, а количество формононетина - увеличивается.

Количественное содержание основных флавонои­дов в исследуемых образцах определялось с помощью количественной ТСХ в тех же условиях. Результаты этого исследования приведены в табл. 2.

Как следует из данных табл. 2, различные виды чины являются богатым источником блофлавоноидов, благодаря которым эти растения проявляют один из видов биологической активности.

Заключение:

Одна из важных задач современной химии – надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических и медицинских исследований, на этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли народного хозяйства. Здесь приведена только незначительная часть методов и приемов тонкослойной хроматографии. Но как видно из этого малого, тонкослойная хроматография обладает значительными и серьезными возможностями, в сочетании с удобством и простотой.

Однако осуществлен и газовый вариант ТСХ. В качестве используют мелкозернистые , Аl 2 О 3 , и др. этих покрывают пластинки из стекла, фольги или ; для закрепления слоя применяют , или др. . Пром-стью выпускаются готовые пластинки с уже закрепленным слоем . Элюентами служат обычно смеси орг. р-рителей, водных р-ров к-т, комплексообразующих и др. в-в. В зависимости от выбора хроматографич. системы (состава подвижной и неподвижной фаз) в разделении в-в осн. роль могут играть процессы , . На практике часто реализуются одновременно неск. механизмов разделения.

В зависимости от положения пластинки и направления потока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную ТСХ. По технике работы выделяют фронтальный анализ (когда подвижной фазой служит анализируемая смесь) и обычно используемый элюционный вариант. Применяют также "круговую" (когда анализируемый р-р и р-ритель последовательно подаются в центр пластинки) и "антикруговую" ТСХ (когда анализируемый р-р наносится по окружности и элюент перемещается от периферии к центру пластинки), ТСХ под (когда р-ритель под пропускают через слой , покрытый плотно прижатой ), а также ТСХ в условиях градиента т-ры, состава и т. п. В т. наз. двухмерной ТСХ хроматографич. процесс осуществляют последовательно в двух взаимно перпендикулярных направлениях с разл. элюентами, что увеличивает эффективность разделения. С этой же целью применяют многократное элюирование в одном направлении.

В элюционном варианте на слой наносят капли (объемом 1-5 мкл) анализируемого р-ра и погружают край пластинки в элюент, к-рый находится на дне герметично закрываемой стеклянной камеры. Элюент продвигается по слою под действием капиллярных и гравитационных сил; анализируемая смесь перемещается в том же направлении. В результате многократного повторения и в соответствии с коэф. распределения в выбранной разделяются и располагаются на пластинке отдельными зонами.

После завершения процесса пластинку вынимают из камеры, высушивают и обнаруживают разделенные зоны по собств. окраске или после опрыскивания их р-рами , образующих окрашенные или флуоресцирующие пятна с компонентами разделяемой смеси. Радиоактивные в-ва обнаруживают авторадиографически (экспонированием на , наложенную на , пластинку). Применяют также . и тивные методы детектирования. Полученная картина распределения хрома-тографич. зон наз. хроматограммой (см. рис.).

Хроматограмма, полученная при разделении смеси трех компонентов методом тонкослойной .

Положение хроматографич. зон на хроматограмме характеризует величина R f -отношение пути l i , пройденного центром зоны i-го компонента от линии старта, к пути l, пройденному элюентом: R f = l i /l; R f 1. Величина R f зависит от коэф. распределения () и от соотношения объемов подвижной и неподвижной фаз.

На разделение в ТСХ влияет ряд факторов-состав и св-ва элюента, природа, и , т-ра, размеры и толщина слоя , размеры камеры. Поэтому для получения воспроизводимых результатов необходимо тщательно стандартизовать условия опыта. Соблюдение этого требования позволяет устанавливать R f с относит. стандартным отклонением 0,03. В стандартных условиях R f постоянна для данного в-ва и используется для последнего.

Кол-во компонента в хроматографич. зоне определяют непосредственно на слое по площади зоны (обычно ее диаметр варьирует от 3 до 10 мм) или интенсивности ее окраски (). Используют также автоматич. сканирующие приборы, измеряющие поглощение, пропускание или отражение света, либо хроматографич. зон. Разделенные зоны можно соскоблить с пластинки вместе со слоем , экстрагировать компонент в р-ритель и анализировать р-р подходящим методом ( , люминесцентный, атомно-абсорбци-онный, атомно-флуоресцентный, радиометрич. анализ, и т.д.). Погрешность количественного определения обычно составляет 5-10%; пределы обнаружения в-в в зонах -10 -3 -10 -2 мкг (по окрашенным производным) и 10 -10 -10 -9 мкг (с применением ).

Достоинства ТСХ: простота, экономичность, доступность оборудования, экспрессность (продолжительность разделения 10-100 мин), высокие производительность и эффективность разделения, наглядность результатов разделения, простота обнаружения хроматографич. зон.

ТСХ применяют для разделения и анализа как орг., так и неорг. в-в: практически всех неорг.

Хроматография в современной химии

Одна из важных задач современной химии – надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических и медицинских исследований, на этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли народного хозяйства.

Один из наиболее чувствительных методов – хроматографический анализ, впервые предложенный российским ученым М.С.Цветом в начале XX в. и к концу века превратившийся в мощнейший инструмент, без которого уже не могут обходиться как синтетики, так и химики, работающие в других областях.

Разделение Цвет проводил в колонке, показанной на рис. 1. Смесь веществ А, Б и В – природных пигментов, первоначально находящихся в зоне е, – разделяется при приливании соответствующего растворителя Д (элюент) на отдельные зоны.

Как всегда, все началось, казалось бы, c самого простого, что мог проделать любой школьник. В прежние годы школьники, в том числе и автор этой статьи, писали чернилами. И если промокашка попадала на чернильное пятно, то можно было заметить, что раствор чернил разделялся на ней на несколько «фронтов». Хроматография основана на распределении одного из нескольких веществ между двумя, как говорят, фазами (например, между твердым телом и газом, между двумя жидкостями и др.), причем одна из фаз постоянно перемещается, т. е. является подвижной.

Это значит, что такая фаза, например газ или жидкость, все время продвигается, нарушая равновесие. При этом чем лучше то или иное вещество сорбируется (поглощается) или растворяется в неподвижной фазе, тем скорость его движения меньше, и, наоборот, чем меньше сорбируется соединение, т. е. обладает меньшим сродством к неподвижной фазе, тем скорость перемещения больше. В итоге, как показано на рис. 2, если вначале мы имеем смесь соединений, то постепенно все они, подталкиваемые подвижной фазой, движутся к «финишу» с различными скоростями и в конце концов разделяются.

Рис. 2. Основной принцип хроматографического разделения: НФ – слой неподвижной фазы, покрывающей внутреннюю поверхность капиллярной трубки Т, через которую течет подвижная фаза (ПФ). Компонент А 1 разделяемой смеси обладает большим сродством к подвижной фазе, а компонент А 2 – к неподвижной фазе. А " 1 и А " 2 – положения зон тех же компонентов через промежуток времени, за которое происходило хроматографическое разделение в направлении, указанном стрелкой

Практически образец смеси веществ вводят, например, шприцем в слой неподвижной фазы, а затем различные соединения, входящие в состав смеси, вместе с подвижной фазой (элюент) двигаются вдоль слоя, подгоняемые этой фазой. Скорость перемещения зависит от величины взаимодействия (сродство) компонентов в неподвижной и подвижной фазах, и в результате достигается разделение компонентов.

После разделения необходимо идентифицировать все компоненты и оценить их количественно. Такова общая схема хроматографии.

Следует отметить, что этот современный метод позволяет в течение нескольких минут определить содержание десятков и сотен различных соединений в смеси, причем даже в ничтожных, «следовых» количествах ~10–8%.

Рассмотрим подробнее хроматографический способ анализа. Хроматографические системы можно разделить по следующим принципам:

– агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз;
– геометрические характеристики системы;
– механизм взаимодействия между разделяемым веществом и фазами.

В качестве подвижной фазы используется газ или жидкость. В качестве неподвижной, или стационарной, фазы применяются твердые вещества или жидкости.

По расположению фаз хроматографические системы подразделяют на две группы: плоскостные и колоночные.

Последние, в свою очередь, разделяются на:

– насадочные, заполненные зернистым твердым материалом (мелкие шарики), либо являющимся разделительной средой, либо служащим носителем неподвижной жидкой фазы;
– капиллярные, внутренние стенки которых покрыты пленкой неподвижной жидкости или слоем твердого адсорбента (поглотитель).

Взаимодействие между разделяемым веществом и фазами хроматографической системы может осуществляться или на поверхности фазы, или в объеме. В первом случае хроматография называется адсорбционной , во втором – распределительной .

Механизмы разделения молекул в хроматографических системах чаще всего сводятся к следующим:

– неподвижная фаза физически поглощает (сорбирует) разделяемые вещества;
– неподвижная фаза химически взаимодействует с разделяемыми веществами;
– неподвижная фаза растворяет разделяемые вещества из раствора в несмешивающемся растворителе;
– неподвижная фаза имеет пористую структуру, затрудняющую диффузию молекул разделяемых веществ в этой фазе.

Хроматография, начавшись с самодельных устройств типа полоски бумаги, опущенной в растворитель, в настоящее время представлена сложнейшими инструментальными системами, основанными на современных точнейших, или прецизионных, принципах и оснащенными компьютерным обеспечением. Достаточно сказать, что одна из лучших компьютерных фирм «Хъюлетт-Паккард» одновременно выпускает и современные хроматографы.

Схема процесса хроматографирования, в сущности, очень проста и показана на рис. 3. Далее примерно в такой последовательности будет рассмотрен принцип работы хроматографа.

Основные виды хроматографии

К основным видам хроматографии относят адсорбционную, ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную, гель-фильтрационную и афинную хроматографию.

Адсорбционная хроматография. В этом случае разделение веществ осуществляется за счет выборочной (селективной) адсорбции веществ на неподвижной фазе. Такая селективная адсорбция обусловлена сродством того или иного соединения к твердому адсорбенту (неподвижной фазе), а оно, в свою очередь, определяется полярными взаимодействиями их молекул. Поэтому часто хроматографию такого типа используют при анализе соединений, свойства которых определяются числом и типом полярных групп. К адсорбционной хроматографии причисляют ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную и газо-адсорбционную хроматографию. Газоадсорбционная хроматография более детально описана в разделе «Элюентный анализ».

Ионообменная хроматография. В качестве неподвижной фазы используют ионообменные смолы (рис. 4) как в колонках, так и в виде тонкого слоя на пластинке или бумаге. Разделение обычно проводят в водных средах, поэтому этот метод используется главным образом в неорганической химии, хотя применяются и смешанные растворители. Движущей силой разделения в этом случае является различное сродство разделяемых ионов раствора к ионообменным центрам противоположной полярности в неподвижной фазе.

Жидкостная хроматография. В этом случае неподвижной фазой служит жидкость. Наиболее распространенным случаем является адсорбционный вариант жидкостной колоночной хроматографии. Пример разделения природных пигментов представлен на рис. 5.

Рис. 5. Хроматографическое разделение природных пигментов (флавонов и изофлавонов)

Бумажная хроматография. В качестве неподвижной фазы используют полосы или листы бумаги (рис. 6). Разделение происходит по адсорбционному механизму, причем иногда его проводят в двух перпендикулярных направлениях.

Тонкослойная хроматография – это любая система, в которой неподвижной фазой является тонкий слой, в частности слой оксида алюминия (толщина 2 мм) в виде пасты, нанесенной на стеклянную пластинку. Пример такой системы и результаты разделения показаны на рис. 7.

Гель-фильтрационная, или молекулярно-ситовая, хроматография. Принцип разделения в таких системах несколько иной, чем в предыдущих случаях. Неподвижной фазой являются материалы, обычно гели, со строго контролируемой пористостью, в результате чего одни компоненты смеси в соответствии с размером и формой молекул могут проникать между частицами геля, а другие не могут. Наиболее часто этот вид хроматографии используется для разделения высокомолекулярных соединений. Один из вариантов применения этого метода – определение молекулярных масс разделяемых веществ, часто необходимых для химических исследований (рис. 8).

Афинная хроматография. Этот вид хроматографии основан на взаимодействии между веществом, с одной стороны, способным реагировать с выделяемым соединением, а с другой – связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество обладает сродством к выделяемому соединению и называется афинным лигандом.

Наиболее часто этот метод находит применение в биохимическом анализе. Например, при пропускании через целлюлозу, активированную бромцианом, биологических объектов-антигенов, содержащих белки, происходит их специфическое удерживание, как показано на схеме 1.

По другому способу для присоединения белков к гидроксильной группе целлюлозы последнюю сначала обрабатывают 2-амино-4,6-дихлор-сим -триазином, а затем продукт их взаимодействия вступает в реакцию с аминогруппой белка по схеме 2:

Конечно, число способов хроматографирования не ограничивается перечисленными выше. Часто хроматографию сочетают с другими физико-химическими методами, например с масс-спектрометрией, но в данной статье стоит задача познакомить читателя лишь с общими принципами хроматографии. Поэтому далее рассмотрим обработку результатов хроматографирования.

Методы проявления хроматограмм

Проявлением называется процесс переноса разделяемых веществ подвижной фазой. Проявление можно осуществить тремя основными способами: фронтальным анализом, вытеснением и элюированием. Наиболее широко используется элюирование.

Фронтальный анализ. Это случай наиболее простой, т. к. здесь проба и служит подвижной фазой. Ее непрерывно добавляют в систему, поэтому нужны большие объемы пробы. Результаты показаны на рис. 9.

Образование нескольких зон обусловлено различным сродством разных компонентов к неподвижной фазе. Передний край называют фронтом, отсюда и название. В первой зоне находится только наименее удерживаемое вещество А, которое движется быстрее всего. Вторая зона содержит вещество А и Б. Третья зона – смесь веществ А, Б и В. Во фронтальном анализе только компонент А получают в жидком виде.

Вытеснительный анализ. В этом случае подвижная фаза обладает большим сродством к неподвижной фазе, чем разделяемое вещество. В неподвижную фазу вводят небольшую пробу. Но из-за большого сродства подвижная фаза вытесняет и проталкивает все компоненты. Она вытесняет наиболее сильно сорбирующийся компонент В, который, в свою очередь, вытесняет вещество Б, а тот вытесняет наименее сорбирующийся компонент А. В отличие от фронтального анализа с помощью этого способа можно получить все основные компоненты в индивидуальном (жидком) виде.

Элюентный анализ. Подвижную фазу для перемещения растворенного вещества пропускают через хроматографическую систему. Разделение происходит за счет различного сродства компонентов смеси к неподвижной фазе и, следовательно, за счет разных скоростей их перемещения. Пробу малого объема вводят в хроматографическую систему. В итоге зоны с компонентами будут постепенно образовывать отдельные участки, разделенные чистым элюентом. Благодаря высокой эффективности разделения метод получил наиболее широкое распространение и в значительной степени вытеснил другие варианты разделения. Поэтому далее рассмотрим теорию и аппаратное оформление этого метода.

Немного теории. Хроматографические процессы часто удобно рассматривать как серии экстракционных процессов, при этом могут быть разделены вещества с очень близкими свойствами, т. к. в ходе хроматографических процессов быстро и одновременно происходят сотни и даже тысячи циклов экстракции.

Для оценки эффективности хроматографических процессов, исходя из теоретического представления о дистилляции (по аналогии с разделением нефти на ректификационных колоннах, где теоретическая тарелка соответствует части ректификационной колонны, в которой пар и жидкость находятся в равновесии), вводят понятие «высота, эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ). Хроматографическая колонка, таким образом, рассматривается как набор гипотетических слоев (тарелок). Под ВЭТТ обычно подразумевают такую толщину слоя, которая необходима для того, чтобы смесь, поступившая из предыдущего слоя, пришла в равновесие со средней концентрацией вещества в подвижной фазе этого слоя. Ее можно описать следующей формулой:

ВЭТТ = L /N ,

где L – длина колонки, N – число теоретических тарелок.

ВЭТТ является суммарной характеристикой разделения веществ. Однако разделить компоненты смеси важно, но недостаточно. Необходимо идентифицировать каждый компонент и определить его количество в пробе. Обычно это осуществляют с помощью обработки хроматограмм – зависимости интенсивности сигнала, пропорционального концентрации вещества, от времени разделения. Некоторые примеры хроматограмм показаны на рис. 10, 11.

Время от момента ввода пробы в колонку до момента регистрации максимума пика называется временем удерживания (tR ). В оптимальных условиях оно не зависит от количества введенной пробы и с учетом геометрических параметров колонки определяется строением того или иного соединения, т. е. является качественной характеристикой компонентов. Количественное содержание компонента характеризуется величиной пика, точнее его площадью. Подсчет площади пика обычно осуществляют автоматически с помощью прибора интегратора, который фиксирует и время удерживания, и площадь пика. Современная аппаратура позволяет сразу получать компьютерную распечатку с указанием содержания всех компонентов разделяемой смеси.

Работа хроматографа. Схема установки наиболее простого газового хроматографа приведена на рис. 12. Она состоит из газового баллона, содержащего подвижную инертную фазу (газ-носитель), чаще всего гелий, азот, аргон и др. С помощью редуктора, уменьшающего давление газа до необходимого, газ-носитель поступает в колонку, представляющую собой трубку, заполненную сорбентом или другим хроматографическим материалом, играющим роль неподвижной фазы.

Рис. 12. Схема работы газового хроматографа:
1 – баллон высокого давления с газом-носителем; 2 – стабилизатор потока; 3 и 3 " – манометры; 4 – хроматографическая колонка; 5 – устройство для ввода пробы; 6 – термостат; 7 – детектор; 8 – самописец; 9 – расходомер

Хроматографическая колонка – это «сердце» хроматографа, поскольку именно в ней происходит разделение смесей. Колонки чаще всего изготавливают из стекла; бывают стальные, тефлоновые, а также капиллярные колонки. Вблизи от ввода газа в колонку устанавливают устройство для ввода пробы. Чаще всего вводят пробу с помощью шприца, протыкая резиновую мембрану. Анализируемая смесь разделяется в колонке и поступает в детектор – прибор, преобразующий результаты разделения в форму, удобную для регистрации.

Одним из наиболее используемых детекторов является катарометр, принцип действия которого основан на измерении теплоемкости разных тел.

На рис. 13 показана схема катарометра. В цилиндрическую полость помещена металлическая спираль (нить сопротивления), нагревающаяся в результате прохождения через нее постоянного электрического тока. При протекании через нее газа-носителя c постоянной скоростью температура спирали остается постоянной. Однако если состав газа меняется при появлении элюируемого вещества, то температура спирали меняется, что и регистрируется прибором.

Другой распространенный детектор – пламенно-ионизационный, схема которого представлена на рис. 14. Он гораздо более чувствителен, чем катарометр, но требует подачи не только газа-носителя, но и водорода. Выходящий из колонки газ-носитель, содержащий элюент, смешивается с водородом и проходит в форсунку горелки детектора. Пламя ионизирует молекулы элюента, в результате чего электрическое сопротивление между электродами уменьшается, а ток увеличивается.

В жидкостной хроматографии применяются спектрофотометрические детекторы (в видимой, УФ- и ИК-областях), а также рефрактометрические детекторы, основанные на измерении показателей преломления растворов.

Таковы в общих чертах азы хроматографического анализа. Конечно, в статье приведены только общие принципы хроматографии, а часто они просто обозначены. На самом же деле «кухня» этого метода достаточно большая и сложная. Главная цель этой статьи, по мнению автора, привлечь внимание юных читателей к этому могущественному методу.

Желающие более подробно ознакомиться с этой областью могут использовать литературу, приведенную ниже.

Л и т е р а т у р а

Жуховицкий А.А., Туркельтауб Н.М. Газовая хроматография. М.: Гостоптехиздат, 1962, 240 с.;
Сакодынский К.И., Киселев А.В., Иогансен А.В. и др. Физико-химическое применение газовой хроматографии. М.: Химия, 1973,
254 с.;
Жидкостная колоночная хроматография. В 3 т. Под ред. З.Дейла, К.Мацека, Я.Янака. М.: Мир, 1972;
Березкин В.Г., Алишоев В.Р., Немировская И.Б . Газовая хроматография в химии полимеров. М.: Наука, 1972, 287 с.;
Морозов А.А. Хроматография в неорганическом анализе. М.: Высш. шк., 1972, 233 с.;
Березкин В.Г., Бочков А.С . Количественная тонкослойная хроматография. М.: Наука, 1980, 183 с.;
Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. В 2 т. Под ред. О.Микеш. М.: Мир, 1982, т. 1–2, 783 с.;
Хроматографический анализ окружающей среды. Под ред. Р.Гроба. М.: Мир, 1979, 606 с.;
Кирхнер Ю . Тонкослойная хроматография. В 2 т. М.: Мир, 1981, т. 1, 615 с., т. 2, 523 с.;
Экстракционная хроматография. Под ред. Т.Браун, Г.Герсини. М.: Мир, 1978, 627 с.

В.В.Сафонов,
профессор Московской
государственной текстильной
академии им. А.Н.Косыгина

-> Добавить материалы на сайт -> Аналитическая химия -> Золотов Ю.А. -> "Основы аналитической химии Том 2" ->

Основы аналитической химии Том 2 - Золотов Ю.А.

Золотов Ю.А., Дорохова Б.Н., Фадеева В.И. Основы аналитической химии Том 2 - М.: Высшая школа, 1996. - 461 c.
ISBN 5-06-002716-3
Скачать (прямая ссылка): osnovianalhimt21996.djvu Предыдущая 1 .. 164 > .. >> Следующая
Степанов A.B., Корчемная Е.К. Электромиграционный метод в неорганическом анализе. - M.: Химия, 1979.
Хванг С, Каммермеиер К. Мембранные процессы разделения. - M.: Химия, 1981.
глава 8
Айваэов Б.В. Основы газовой хроматографии. - M.: Высшая школа, 1977. Белявская Т.А., Большова Т.А., Брыкина Г.Д. Хроматография неорганических веществ. - M.: Высшая школа, 1986.
447
Березкин В.Г., Бочков A.C. Количественная тонкослойная хроматография.
- M.: Наука, 1980.
Количественный анализ хроматографическими методами/Под ред. Э. Кэц.
- M.: Мир, 1990.
Перри С, Амос Р., Брюер П. Практическое руководство по жидкостной хроматографии. - M.: Мир, 1974.
Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. - M.: Химия, 1986.
Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. - Рига: Зинатне, 1988.
Шпигун O.A., Золотов Ю.А. Ионная хроматография и ее применение в анализе вод. - M.: Изд-во МГУ, 1990.
Энгельгардт Т.Х. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. - M.: Мир, 1980.
Глава 9
Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Попов К.И. Комплексоны и комплексонаты металлов. - M.: Химия, 1988.
Индикаторы/Под ред. П. Бишопа. Т. і и 2.,- M.: Мир, 1976.
Пршибил Р. Аналитические применения этилендиаминтетрауксусной кислоты и родственных соединений. - M.: Мир, 1975.
Титриметрические методы анализа неводных растворов/Под ред. В.Д. Безуглого. - M.: Химия, 1986.
Эшворт М.Р.Ф. Титриметрические методы анализа органических соединений. Методы прямого титрования. - M.: Химия, 1968.
Глава 10
Бонд А.М. Полярографические методы в аналитической химии. - M.: Химия, 1983.
Корыта И. Ионы, электроды, мембраны. - M.: Мир, 1983.
Майрановский С.Г., Страдынь Я.П., Безуглый В.П. Полярография в органической химии. - M.: Химия, 1975.
Никольский Б.П., Матерова Е.А. Ионоселективные электроды. - Л.: Химия, 1980.
Плэмбек Дж. Электрохимические методы анализа. Основы теории и применение. - M.: Мир, 1985.
Справочное руководство по применению ионоселективных электродов. - M.: Мир, 1986. 448
Глава 11
Бенуэлл К. Основы молекулярной спектроскопии. - M.: Мир, 1985. Брицке М.Э. Атомно-абсорбционный спектрохимический анализ. - M.: Химия, 1982.
Вилков Л.В., Пентин Ю.А. Физические методы исследования в химии. Резонансные и электрооптические методы. - M.: Высшая школа, 1989.
Вилков Л.В., Пентин Ю.А. Физические методы исследования в химии. Структурные методы и оптическая спектроскопия. - M.: Высшая школа, 1987.
Демтрёдер В. Лазерная спектроскопия. - M.: Наука, 1985.
Зайдель А.Н.Атомно-флуоресцентный анализ. Физические основы метода.
- M.: Наука, 1980.
Ионин Б.И., Ершов Б.А., Кольцов А.И. ЯМР-спектроскопия в органической химии. - Л.: Химия, 1983.
Кузнецова Л.А., Кузьменко Н.Е., Кузяков Ю.Я., Пластинин Ю.А. Вероятности оптических переходов двухатомных молекул. - M.: Наука, 1980.
Кузяков Ю.Я., Семененко К.А., Зоров Н.Б. Методы спектрального анализа.
- M.: Изд-во МГУ, 1990.
Пешкова В.М., Громова М.И.Методы абсорбционной спектроскопии в аналитической химии. - M.: Высшая школа, 1976.
Прайс В. Аналитическая атомно-абсорбционная спектроскопия. - M.: Мир, 1976.
Сверхчувствительная лазерная спектроскопия/Под ред. Д. Клайджера.
- M.: Мир, 1986.

Терек Т., Мика Й., Гегуш Э. Эмиссионный спектральный анализ. Т. 1 и 2.
- M.: Мир, 1982.
Томпсон M., Уолш Д.Н. Руководство по спектрометрическому анализу с индуктивно связанной плазмой. - M.: Недра, 1988.
Чудинов Э.Г.Атомно-эмиссионный анализ с индукционной плазмой.//Итоги науки и техн. - M.: ВИНИТИ. 1990.
Глава 12
Полякова A.A. Молекулярный масс-спектральный анализ органических соединений. - M.: Химия, 1983.
Спектроскопические методы определения следов элементов/Под ред. Дж. Вайнфорднера. - M.: Мир, 1979.
Сысоев A.A., Чупахин М.С. Введение в масс-спектрометрию. - M.: Атом-издат, 1977.
449
Глава 13
Кузнецов P.A. Активационный анализ. - M.: Атомиздат, 1974. Новые методы радиоаналитической химии/Под ред. Г.Н. Билимович и М. Кирша. - M.: Энергия, 1982.
Глава 14
Павлова С.А., Журавлева И.В., Толчинский Ю.И. Термический анализ органических и высокомолекулярных соединений. - M.: Химия, 1983.
Топор Н.Д., Огородова Л.П., Мельчакова Л.В. Термический анализ минералов и неорганических соединений. - M.: Изд-во МГУ, 1987.
Уэндландт У. Термические методы анализа. - M.: Мир, 1978.
Шестак Я. Теория термического анализа. Физико-химические свойства твердых неорганических веществ. - M.: Мир, 1987.
Глава 15
Баркер Ф. Компьютеры в аналитической химии. - M.: Мир, 1987.
Джонсон К.Д.Численные методы в химии. - M.: Мир, 1983.
Джуре П., Айэенауэр Т. Распознавание образов в химии: - M.: Мир, 1977.
Математические методы и ЭВМ в аналитической химии/Под ред. Л.А. Грибова. - M.: Наука, 1989.
Учи Г. Персональные компьютеры для научных работников. - M.: Мир, 1990.
Форсайт Д., Малькольм M., Моулер К. Машинные методы математических вычислений. - M.: Мир, 1980.