Доброй традицией Нобелевского комитета становится признание значимости методик, позволяющих «разглядеть» отдельные атомы: в 2014 году отметили сверхразрешающую микроскопию , а 4 октября 2017 года Нобелевскую премию по химии присудили «за разработку метода криоэлектронной микроскопии». Лауреатами стали трое исследователей: Жак Дюбоше из Университета Лозанны, Йохим Франк из Колумбийского университета в Нью-Йорке и Ричард Хендерсон из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже. Заморозка биомолекул в движении позволяет получать их изображения в высоком разрешении, а методики компьютерной реконструкции дают пространственную структуру с точностью до атома. Исследование, начатое еще в 1970-е годы, все лучше и лучше позволяет оценивать архитектуру биоорганических комплексов.
Люди, регулярно читающие статьи в топовых научных журналах, давно уже привыкли к многочисленным молекулярным изображениям. Но микроскопы не позволяют увидеть отдельные молекулы . Правда, существует микроскопия сверхразрешения, за которую в 2014 году дали Нобелевскую премию по химии , но и она не позволяет «разглядеть» отдельные атомы. Изучать строение биологических молекул с такой подробностью - удел структурной биологии , лидирующими методиками которой до недавнего времени считались рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Интересным методом также является атомно-силовая микроскопия , но герой нашего сегодняшнего рассказа другой: это криоэлектронная микроскопия , за разработку которой вручена Нобелевская премия по химии уже этого, 2017 года .
Визуализация сложных структур, прежде считавшихся «невидимыми» ввиду их малых размеров, позволила совершить множество фундаментальных прорывов. Один из них - прогресс в борьбе с вирусом Зика , (рис. 1), недавно вызвавшим пандемию одноименной болезни. Благодаря криоэлектронной микроскопии, в последние пять лет все более прочно входящей в «большую тройку» методов структурной биологии, удалось получить трехмерную модель этого коварного агента. Что, в свою очередь, положило начало поиску потенциальных мишеней для лекарственных веществ, способных справиться с болезнью.
Рисунок 1. Примеры некоторых белковых комплексов. а - Белковый комплекс, регулирующий циркадный ритм. б - Комплекс звукового сенсора уха, считывающий изменения давления и позволяющий нам слышать. в - Модель вируса Зика.
Краткий экскурс в историю микроскопии до 1975 года
Всю первую половину 20 века три самых известных биологических структуры - ДНК, РНК и белок - оставались белым пятном на карте биохимического мира. Было известно, что они есть в организме и играют важную роль в жизни клеток, но каково их строение - никто не имел ни малейшего понятия. Лишь в начале 1950-х годов знаменитая группа ученых из Кембриджа, включавшая Френсиса Крика, Джеймса Уотсона, Мориса Уилкинса и Розалинд Франклин, впервые попробовала облучать ДНК рентгеновскими лучами, что привело к открытию прославленной двойной спирали.
К кристаллографам относился поначалу и Ричард Хендерсон , получивший за свои ранние исследования пусть не Нобелевскую премию, но докторскую степень. Метод рентгеноструктурного анализа заключается в дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке, что помогает идентифицировать структуру молекулы. Но в то время он был еще далек от совершенства, хотя сегодня это один из основных способов изучения структуры вещества . Шагнув на 30 лет вперед, мы узнаем, что наука получила еще один способ расшифровывать строение биомолекул: в 1980-х годах для изучения структуры и динамики белков в растворе начали применять метод ядерного магнитного резонанса (и применяют до сих пор ).
Благодаря этим двум методам удалось накопить внушительные объемы информации по строению биологических молекул: на сегодня в базе PDB находится более 100 тыс. структур. Но, как это часто бывает, и у того, и у другого метода есть свои недостатки. Так, с помощью ЯМР можно визуализировать только белки, находящиеся в растворе, и размер их должен быть небольшим. А минус рентгеновской кристаллографии считывается в названии метода: он работает на стабильных структурах типа кристаллов, но не на динамических «живых» молекулах. Изображения, полученные с помощью этого метода, напоминают снимки первых в истории фотокамер: черно-белые и застывшие, не несущие в себе информации о подвижной структуре белка. Эта проблема заставила Ричарда Хендерсона бросить рентгеновскую кристаллографию в 1970-х, что и стало отправной точкой на его пути к Нобелевской премии 2017 года.
Шаг первый: бактериородопсин под прицелом электронного пучка
Хендерсона с самого начала интересовали мембранные белки. Почему же их визуализация оказалась неподвластна рентгеновскому методу на тот момент? Неудачи возникали при попытках кристаллизовать белок, тем самым нарушая его естественное состояние в липидной мембране клетки. Мембранные белки крайне трудно извлекать из мембраны, не нарушая их нативного состояния : очень часто они просто «слипаются» в единую массу, неподвластную дальнейшему изучению. Впрочем, сейчас и в кристаллизации мембранных белков есть большой прогресс: мембрану просто научились делать частью кристалла .
После ряда неудачных попыток Ричард Хендерсон обратился к единственному, казалось, реальному варианту: электронной микроскопии. В чем принципиальное отличие электронного микроскопа от оптического? В просвечивающей электронной микроскопии (так называется эта техника) вместо пучка света к образцу посылается луч электронов. Длина волны электронов намного меньше, чем длина волны света, поэтому с помощью электронного микроскопа можно визуализировать даже очень маленькие структуры - вплоть до уровня отдельных атомов.
В теории электронный микроскоп идеально подходил для исследований Ричарда Хендерсона - ведь он позволял получить изображения мембранных белков на атомном уровне. Но на практике эта идея казалась нереальной. Со времен изобретения электронного микроскопа считалось, что с помощью этого метода можно изучать исключительно неживую материю. Виной тому электронный пучок: он позволяет получать картинки с высоким разрешением, но фактически «сжигает» на своем пути живые структуры. Если же снизить его интенсивность, то изображение теряет контраст и получается нечетким.
Дополнительной преградой на пути визуализации биомолекул под электронным микроскопом является необходимость создания вакуума. При выкачивании воздуха из биологического образца испаряется и вода, обволакивающая живые структуры, из-за чего они теряют свою естественную форму. Таким образом, все обстоятельства выступали против Хендерсона. Однако его идею спас особый белок, обладающий исключительной стабильностью в мембране - бактериородопсин.
В 1991 году Йоахим Франк «заморозил» рибосомы по методу Дюбоше, получив на выходе изображение их трехмерной структуры. И, несмотря на то, что картинка была сделана в небывалом для электронной микроскопии разрешении, исследователям удалось показать лишь очертания рибосомы. Странные каплевидные структуры все еще не выдерживали сравнения с атомным разрешением рентгеновской кристаллографии. Криоэлектронная микроскопия позволяла визуализировать лишь неверные контуры электронной плотности, напоминающие пузыри, из-за чего этот метод в шутку называли «блобология» (blobology ) . Но прогресс идет вперед, и после 2010 года получил распространение новый тип электронного детектора - Direct Electron Detector , позволяющий получать гораздо более детальное изображение биологических структур .
Сегодня криоэлектронная микроскопия позволяет «ловить» биологические структуры «в динамике» на разных этапах. Совмещая полученные снимки, исследователям удается создавать целые фильмы, демонстрирующие перемещения и взаимодействия белков с другими молекулами. За последние пять лет чуть ли не каждая вторая молекулярная структура, опубликованная в журналах уровня Science и Nature , криомикроскопическая: это и новые состояния рибосомы , и АТФазы , и различные рецепторы , и филаменты загадочного тау-пептида , и инфламмосома , и термочувствительный ионный канал TRPV1 , и многое другое. И это только начало: ученым еще предстоит определить точную структуру и механизм работы множества белков и других сложных биологических структур.
Литература
- 12 методов в картинках: микроскопия ;
- По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014 ;
- 12 методов в картинках: структурная биология ;
- Атомно-силовая микроскопия: увидеть, прикоснувшись ;
- Fernholm A. (2017).
Нобелевская премия по химии за 2017 год присуждена Жаку Дюбуше (Jacques Dubochet), Иохиму Франку (Joachim Frank) и Ричарду Хендерсону (Richard Henderson) за разработку метода криоэлектронной микроскопии, которая позволила рассмотреть в подробностях - с очень высоким разрешением - молекулы живых организмов.
Жак Дюбуш - швейцарец, трудится в Университете Лозанны (University of Lausanne, Switzerland), Иохим Франк - американец из Колумбийского университета (Columbia University, New York, USA), Ричард Хендерсон - британский ученый из Кембриджа (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK).
В подчеркнуто, что исследования лауреатов, продолжавшиеся в 70-е - 90-е годы прошлого века, обеспечили революционный прорыв в биологии, поскольку позволили впервые взглянуть на то, что прежде было совсем невидимым - на отдельные биологические молекулы и даже на составляющие их атомы.
По сути ученые модернизировали электронную микроскопию. Прежде в электронный микроскоп наблюдали неживую материю. Лауреаты приспособили его к наблюдению за объектами живой природы. Научились замораживать их в водяном растворе так, что биомолекулы сохраняли свою форму, свойства и при этом «закреплялись» в удобном для наблюдения за ними виде.
В итоге, с помощью электронного микроскопа стало возможным получать трехмерные изображения рассматриваемых живых объектов. К 2013 году разрешение метода стало феноменальным. Появились изображения всевозможных молекулярных белков - например, тех, благодаря которым у бактерий появляется устойчивость к антибиотикам. Удалось «сфотографировать» даже вирусы - например, вирус Зика . Что сулит ближайшую победу над ним.
Исследователи, проникшие в микромир, отмечают: подробная картинка некого объекта - это кратчайший путь к пониманию его сути. То есть, к познанию. Просто очевидно, что Шведская королевская академия наук, присуждающая Нобелевские премии, разделяет это мнение.
СПРАВКА КП
Нынешняя Нобелевская премия по химии - 109-я по счету. Среди лауреатов, которые были удостоены этой - самой почетной в мире научной награды начиная с 1901 года, - 4 женщины.
Британский ученый Фредерик Сэндгер, включенный в список «100 гениев современности», получил Нобелевскую премию по химии дважды - в 1958 году и в 1980 году. Первый раз - за определение точной последовательности аминокислот в молекуле инсулина. Второй - за разработку метода расшифровки первичной структуры ДНК .
В прошлом году премия ушла ученым из Франции, США и Голландии. Француз Жан-Пьер Саваж (Jean-Pierre Sauvage), американец сэр Джеймс Фрезер Стоддарт (Fraser Stoddart) и голландец Бернард Лукас Феринга (Bernard L. Feringa) были награждены «за разработку и синтез молекулярных машин». Луреаты фактически заложили материальную основу нанотехнологии.
Нобелевская премия по химии в 2017 году была присуждена за развитие криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения структур биомолекул в растворах. Лауреатами стали из Лозаннского университета, Иоахим Франк из Колумбийского университета и из Кембриджского университета.
Криоэлектронная микроскопия - это форма просвечивающей электронной микроскопии, в которой образец исследуется при криогенных температурах.
Метод популярен в структурной биологии, так как позволяет наблюдать за образцами, которые не были окрашены или каким-либо образом зафиксированы, показывая их в их родной среде.
При электронной криомикроскопии замедляется движение входящих в молекулу атомов, что позволяет получать очень четкие изображения ее структуры. Получаемые о строении молекул сведения чрезвычайно важны, в том числе, для более глубокого понимания химии и развития фармацевтики.
Многие прорывы в науке связаны с успешной визуализацией объектов, невидимых человеческому глазу. Оптическая микроскопия позволила доказать существование микроорганизмов, взглянуть на сперматозоиды и яйцеклетки, частично изучить клеточную структуру и даже разглядеть хромосомы. Преодолеть физические ограничения оптических телескопов позволила электронная микроскопия, где вместо светового потока использовался пучок электронов.
Однако и у нее были свои изъяны. Во-первых, мощный пучок электронов разрушал биологический материал. Во-вторых, чтобы разогнаться электронам необходим вакуум - соответственно, в вакууме должен был находиться и препарат.
Поэтому изучать с ее помощью «живые» образцы было невозможно.
Вклад Иоахима Франка способствовал широкому распространению метода. Еще в 1975-1986 годах он разработал метод обработки изображений, заключавшийся в анализе полученных с помощью электронного микроскопа двумерных изображений и построения на их основе трехмерных структур изучаемых объектов.
Жак Дюбоше предложил использовать для сохранения образцов быстро охлажденную воду. Охлаждение образцов как способ их сохранения рассматривалось учеными довольно давно. Однако при замерзании воды и образовании кристаллической решетки структура образцов разрушалась. А в жидком виде она испарялась в вакуумной камере электронного микроскопа, опять-таки приводя к разрушению изучаемых молекул.
Наконец, был найден способ обойти фазу кристаллизации и добиться того, чтобы вода переходила в стеклообразное состояние. Метод был назван витрификацией.
При витрификации вода оказалась способна предохранять молекулы от разрушения даже в вакууме.
Эти открытия дали мощный толчок развитию электронной микроскопии. В 2013 году ученые смогли рассмотреть даже отдельные атомы вещества.Такое высокое разрешение позволяет рассматривать рибосомы и митохондрии клеток, ионные каналы и ферментные комплексы.
В 2015 году журнал Nature Methods назвал одночастичную криоэлектронную микроскопию прорывным методом года.
Последние технические достижения в этой области позволили ученым отойти от метода рентгеновской кристаллографии, главный недостаток которой — необходимость кристаллизации белка, что может быть затруднительно для белков со сложной структурой. Научные журналы последних лет пестрят детальными изображениями поверхности вируса Зика и белков, вызывающих устойчивость к антибиотикам. В частности, удалось , как бактерии золотистого стафилококка противостоят действию антибиотиков и снимок структуры, с помощью которой коронавирусы проникают в клетки.
Несмотря на быстрый прогресс в этой области, стоимость оборудования и стандартизированные методы несколько замедляют повсеместное распространение технологии криоэлектронной микроскопии.
Среди претендентов на Нобелевскую премию по химии числился россиянин — ведущий научный сотрудник Института химической физики (ИХФ) им. Н. Н. Семенова , вместе с коллегами из США и он сделал весомый вклад в область углеродно-водородной функционализации — отрасли, разрабатывающей новые методы синтеза органических соединений. Также в списке возможных лауреатов значились датчанин Йенс Норсков за фундаментальные достижения в области гетерогенного катализа на твердых поверхностях и команда из химиков Тсутому Миясаки, Нам-Гю Парка и Генри Снейта за открытие минерала перовскита и разработки на его основе.
В 2016 году премия была Жан-Пьеру Соважу, Стоддарту и Бернарду Феринге за изобретение молекулярных машин.
