Видовая идентификация бактерий методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК, роль и место метода в диагностике бактериальных инфекций Выполнила: Савельева Ксения, Выполнила: Савельева Ксения, ученица 11 специализированного класса ученица 11 специализированного класса МБОУ Краснообской СОШ 1 МБОУ Краснообской СОШ 1 Научный руководитель: Научный руководитель: канд. биол. наук Афонюшкин Василий Николаевич канд. биол. наук Афонюшкин Василий Николаевич


Задачи: 1. Освоить метод электрофореза ДНК в геле агарозы 2. Освоить метод анализа результатов секвенирования и провести построение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16 S рибосомальной РНК полученных изолятов рода Bacillus 1. Освоить метод электрофореза ДНК в геле агарозы 2. Освоить метод анализа результатов секвенирования и провести построение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16 S рибосомальной РНК полученных изолятов рода Bacillus 3. Изучить перспективы совместного использования методов секвенирования и биохимической идентификации бактерий 3. Изучить перспективы совместного использования методов секвенирования и биохимической идентификации бактерий Цель исследования: Изучить возможности метода видовой идентификации бактерий методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК в сочетании с традиционными методами идентификации


Материалы и методы Чистые культуры изолятов высевали на МПА и после часов инкубации готовили бактериальную взвесь на фосфатно-солевом буфере. Культуры окрашивали по Грамму и микроскопировали. Оценивали следующие биохимические свойства: Утилизация цитрата, малоната, глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы, инозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, фенилаланина, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарабинола (Реакция Фогес- Проскауэра), наличие бета-галактозидазы, уреазы, декарбоксилаз аргинина и лизина, гидролазы аргинина. Культуры тестировали на каталазную, цитохромоксидазную активности, образование нитритов, синтез пигментов, антибиотикорезистентность, изучали культуральные и морфологические свойства. Бетта-галактозидазную, тритофандезаминазную и глюкоронидазную активности проверяли на среде Уриселект 4 (BioRad).ДНК выделяли фенолхлороформенным методом, вид определяли на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНКи межгенного спейсера 16-23S рибосомальной РНК и совокупности биохимических, культурных и морфологических признаков.


Культуральные свойства: выросшие культуры не росли на среде Эндо т.е. не относились к энтеробактериям, росли на мясопептонном агаре а аэробных условиях при 37С Тинкториальные свойства: выросшие культуры исследовали микроскопически и окрашивали по Граму, что позволило установить что полученные культуры относятся к спорообразующим Гр+ палочкам Характеристики культур




Раствор с праймером распределяют по 4 пробиркам, в каждой из которых находятся 4 дезоксинуклеотида dАТР,dСТР, dТТР(один из них –меченный радиоктивным изотопом) и один из четырех 2;3- дидезоксинуклеотидов(ddАТР,ddТТР,ddGTP,dd СТР) Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигнуклеотидов разной длины, включающих праймеровую последовательность. Далее в пробирки добавляют формалид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриловом геле на четерых дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть»нуклеиновую последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул белков и нуклеиновых кислот (а также их фрагментов). Различают множество разновидностей этого метода. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества и используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.белковнуклеиновых кислот Электрофорез это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля.электрокинетическое явлениеэлектрического поляЭлектрофорез Схема исследований: продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в агарозном геле. Метод Сэнгера








Результаты биохимических исследований культур с использованием тестов ПБДЭ Биохимические свойства штамма B.licheniformis: утилизация цитрат отрицательно, малонат отрицательно, цитрат натрия +глюкоза отрицательно, лизин отрицательно, аргинин отрицательно, орнитин отрицательно, фенилаланин отрицательно, индол отрицательно, ацетилметилкарабинол положительно уреаза отрицательно, сероводород отрицательно, глюкоза положительно, б-галактозидаза положительно, лактоза отрицательно, манит положительно, сахароза положительно, инозит положительно, сорбит положительно, мальтоза положительно


Заключение Видовая идентификация микроорганизмов на основе секвенирования может являться «золотым стандартом» лабораторной диагностики, однако точность метода ограничена достоверностью и полнотой баз данных GenBank и, следовательно, требует дополнительного использования подтверждающих тестов.



100 р бонус за первый заказ

Выберите тип работы Дипломная работа Курсовая работа Реферат Магистерская диссертация Отчёт по практике Статья Доклад Рецензия Контрольная работа Монография Решение задач Бизнес-план Ответы на вопросы Творческая работа Эссе Чертёж Сочинения Перевод Презентации Набор текста Другое Повышение уникальности текста Кандидатская диссертация Лабораторная работа Помощь on-line

Узнать цену

Молекулярная гибридизация 16S рРНК. Рибосома прокариот состоит из 3 субъединиц, большой (23S), (5S) и (16S). Ген 16 S рРНК обладает следующими свойствами, важными в филогении:

1. РНК рибосом универсальна для разных видов, как и сами рибосомы. 2.Молекула 16S рРНК – консервативна и наименее подвержена изменениям в ходе биологической эволюции. Скорость изменения гена 16S рРНК у различных бактерий-симбионтов составила 2-4% замен нуклеотидов в течение 60 млн. лет.3. Ген 16S рРНК имеет как ультраконсервативные, так и вариабельные области (домены), что дает возможность оценивать отдаленные и близкие родственные отношения.4. Кроме того, было установлено, что цистроны рРНК не вовлекаются в процессы межвидового генетического переноса.5. Размер гена (у прокариот он примерно 1550-1640 п.н. длиной) оптимален с точки зрения снижения статистических ошибок. Полный сиквенс можно определить за одно секвенирование методом Сэнгера.Сравнение нуклеотидных каталогов. Метод применялся в начале 80-х годов и имел большое историческое значение в систематике бактерий. При этом молекула РНК (16S рРНК) обрабатывалась рибонуклеазой Т, расщепляющей молекулу по остаткам гуанина. Размер полученных фрагментов составлял не более 20 нуклеотидов. Полученные олигонуклеотиды разделяли путем 2-мерного электрофореза, секвенировали, и составляли каталог, специфично характеризующий молекулу рРНК. При сравнении каталогов учитывались фрагменты длиной не менее 6 нуклеотидов. Путем применения коэффициентов сходства между каталогами впервые было построено общее филогенетическое дерево для прокариот. Рибопринтинг. Метод основан рестрикционном анализе генов рРНК. Для этого выделяют тотальную ДНК из клетки. Берут два праймера, гомологичных к высоко консервативным, фланкирующим участкам 16S рРНК (small subunit - ss rDNA) гена и проводят ПЦР. Фрагменты обрабатываются несколькими эндонуклеазами рестрикции, и продукты рестрикции для каждой из эндонуклеаз разделяются в агарозном геле вместе с профилем размерного стандарта ДНК. Полиморфизм длин фрагментов возникает благодаря тому, что часть сайтов рестрикции попадают в консервативные домены гена, а часть – в вариабельные домены. При этом часть фрагментов будут общими для всех видов в выборке. По количеству общих и различающихся фрагментов можно вычислять генетическую дистанцию между видами. Применение 12 рестриктаз с сайтами узнавания длиной в 4 нуклеотида позволяет охватить анализом 10-15% длины гена 16S рРНК, не прибегая к секвенированию.

16S рРНК — один из трех типов рибосомной РНК (рРНК), которые локализуются в рибосомах прокариот. Имеют среднюю величину среди этих рРНК. Константа седиментации равна 16S (единиц Сведберга) для других рРНК константы уровне 5 и 23 S. В состав 16S рРНК входит 1600 нуклеотидов. У эукариот существуют аналогичные ей 18S рРНК, состоящие из 2500 нуклеотидов.

Рибосомы и РНК присутствуют во всех без исключения клетках, а также некоторых органеллах эукариот (митохондрии, хлоропласты), то есть эти структуры характеризуются древнейшим происхождением. Их функции всегда одинаковы, а первичная структура имеет высокую степень консервативности. Также рРНК находятся вне действия естественного отбора, поэтому молекулы эволюционируют только в результате спонтанных мутаций и количество этих мутаций может служить критерием эволюционной расстояния между организмами.

Из трех типов рРНК 16S и 18S удобнее анализировать, до сих пор изучена последовательность нуклеотидов в 16S и 18S рРНК для многих сотен видов из разных царств живой природы. На основании полученных данных выделено три группы эволюционно сходных организмов, получивших высший ранг доменов. Это:

  • Эукариоты (но не их органеллы),
  • Бактерии (а также митохондрии и хлоропласты эукариот),
  • Археи.

Исследование родства среди бактерий показали наличие 10 эволюционных ветвей, причем в 5 из них обнаружены фотосинтезирующие организмы. То есть последние гораздо более родственные другим нефотосинтезирующие бактериям, чем друг другу. Эти открытия заставляют по-новому смотреть на эволюцию одноклеточных организмов и возникновение фотосинтеза.

Вторичная структура 16S рРНК E. coli – один из трех типов рибосомной РНК (рРНК), локализующиеся в рибосомах прокариот. Имеют среднюю величину среди этих рРНК. Константа седиментации равна 16S (единиц Сведберга), для других рРНК константы уровне 5 и 23 S. В состав 16S рРНК входит 1600 нуклеотидов. У эукариот существуют аналогичные ей 18S рРНК, состоящие из 2500 нуклеотидов.
Атомная структура 30S Subunit в Thermus thermophilus. Протеины показано синим цветом, в то время как единичную полоску РНК показано оранжевым. Рибосомы и РНК присутствуют во всех без исключения клетках, а также некоторых органеллах эукариот (митохондрии, хлоропласты), т.е. эти структуры характеризуются древнейшим происхождением. Их функции всегда одинаковы, а первичная структура имеет высокую степень консервативности. Также рРНК находятся вне действия естественного отбора, поэтому молекулы эволюционируют только в результате спонтанных мутаций и количество этих мутаций может служить критерием эволюционной расстояния между организмами.
Из трех типов рРНК 16S и 18S удобнее анализировать, к настоящему времени изучена последовательность нуклеотидов в 16S и 18S рРНК для многих сотен видов из разных царств живой природы. На основании полученных данных выделено три группы эволюционно сходных организмов, получивших высший ранг доменов. Это:

Эукариоты (но не их органеллы),
Бактерии (а также митохондрии и хлоропласты эукариот),
Археи.

Исследования родства среди бактерий показали наличие 10 эволюционных ветвей, причем в 5 из них обнаружены фотосинтезирующие организмы. То есть они намного более родственны другим нефотосинтезуючим бактериям, чем друг другу. Эти открытия заставляют по-новому смотреть на эволюцию одноклеточных организмов и возникновение фотосинтеза.